孫穎穎，周 豹，徐深圳，李文浩，閻斌倫*

(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005)

球等鞭金藻胞內(nèi)和胞外多糖的分離純化及其抑菌活性

孫穎穎，周 豹，徐深圳，李文浩，閻斌倫*

(淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005)

采用分級(jí)沉淀、Sephadex G-75凝膠柱層析和DEAE-52離子交換柱層析對(duì)球等鞭金藻胞內(nèi)粗多糖(IPS)進(jìn)行分離；對(duì)胞外粗多糖(IEPS)則進(jìn)行Sephadex G-100凝膠柱層析分離。在此基礎(chǔ)上，分析所獲多糖組分對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌等細(xì)菌的抑菌活性。同時(shí)，通過紫外光譜和紅外光譜測(cè)定，比較IPS和IEPS結(jié)構(gòu)的異同。結(jié)果表明：IPS和IEPS均具有抑菌活性，前者抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，后者抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)；IPS經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析分離，獲得2個(gè)多糖組分：IPSⅠ和IPSⅡ。IEPS經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析分離，獲得3個(gè)多糖組分：IEPSA、IEPSB和IEPSC?；钚詸z測(cè)表明，IPSⅠ和IPSⅡ抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)；IEPSA、IEPSB和IEPSC抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)；紫外光譜表明，IPS和IEPS均不含核酸、游離或裸露的蛋白質(zhì)和色素；IPS和IEPS的紅外光譜比較相似，以半乳糖為構(gòu)架，均含有酰氨取代基，但不同之處在于，后者不含硫酸取代基。

球等鞭金藻；胞內(nèi)多糖；胞外多糖；分離純化；抑菌活性

海洋微藻多糖具有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射和降血糖等活性功效[1-5]；且由于海洋微藻的生長(zhǎng)條件和環(huán)境特點(diǎn)決定了其可能具有一些有別于陸生植物多糖的結(jié)構(gòu)和功能，此類多糖在醫(yī)藥和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力越來越引起人們對(duì)其的研究興趣。球等鞭金藻(Isochrysis galbana)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中重要的餌料微藻，以往研究主要集中在脂肪酸上[6-7]。Sukenik[6]、戴俊彪[7]、王長(zhǎng)海[8]等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，球等鞭金藻胞內(nèi)多糖含量較高。然而，有關(guān)球等鞭金藻多糖的分離純化研究較少，且目前尚未見此微藻多糖組分的抑菌活性報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)從球等鞭金藻的藻細(xì)胞和培養(yǎng)液中分別提取胞內(nèi)和胞外粗多糖。隨后，采用分級(jí)沉淀、Sephadex G-75凝膠柱層析、DEAE-52離子交換柱層析以及Sephadex G-100凝膠柱層析等方法對(duì)胞內(nèi)和胞外多糖進(jìn)行分離。在此基礎(chǔ)上，研究多糖組分的抑菌活性，并利用紫外光譜和紅外光譜分析胞內(nèi)和胞外粗多糖結(jié)構(gòu)的異同，以期為深入開展海洋微藻多糖的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

球等鞭金藻由中國(guó)海洋大學(xué)提供，置于40L光照平板生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，通氣量2.0L/min，溫度(23±2)℃，光照強(qiáng)度3000lx，接種密度40×104mL-1，f/2培養(yǎng)基[9]。培養(yǎng)10d后，離心，保存藻細(xì)胞和上清液，分別進(jìn)行如下處理：藻細(xì)胞冷凍干燥，獲得藻粉；上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，低溫冷凍。冷凍干燥后，獲得白色粉末狀的胞外物。

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物種質(zhì)及遺傳資源保藏和利用中心提供。

Sephadex G-75、Sephadex G-100和DEAE-52 美國(guó)Sigma公司；乙醇、三氯乙酸(TCA)、鹽酸、氫氧化鈉、蒽酮、考馬斯亮藍(lán)均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25數(shù)顯pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 北京瑞麗分析儀器公司；HH-S恒溫水浴鍋 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；LG-5真空冷凍干燥機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 球等鞭金藻胞內(nèi)和胞外粗多糖的制備

藻粉中按質(zhì)量比1:20加入蒸餾水，混合均勻后，調(diào)pH值為9，70℃浸提3h。提取結(jié)束后，6000r/min離心10min。上清液加入3% TCA，4℃靜置3h后，6000r/min離心10min。上清液加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇沉淀12h，經(jīng)離心及冷凍干燥等處理后，得58g乳白色粉末，即球等鞭金藻胞內(nèi)粗多糖(Isochrysis galbana polysaccharides，IPS)。

稱取適量球等鞭金藻胞外物質(zhì)干粉末，以料液比1:20加入蒸餾水溶解，調(diào)溶液pH值為10，于80℃提取6 h。提取結(jié)束后，提取液經(jīng)離心、過濾，乙醇沉淀后，制備到24.2g白色粉末，即球等鞭金藻胞外粗多糖(Isochrysis galbana extracellular polysaccharides，IEPS)。

1.3.2 IPS的分離

1.3.2.1 分級(jí)沉淀及Sephadex G-75凝膠柱層析分離

稱取5g IPS重新溶解后，依次用5%、50%和75%乙醇進(jìn)行分級(jí)沉淀，獲得3個(gè)組分，分別記為IPSA、IPSB和IPSC，質(zhì)量依次為1.0、2.0、0.44g。所獲組分重新溶解，配制質(zhì)量濃度為0.05g/L后，將其加載于Sephadex G-75凝膠層析柱(2.3cm×50cm)用蒸餾水進(jìn)行洗脫，每管收集3mL，流速2.5mL/min，餾分采用硫酸-蒽酮法檢測(cè)[10]。多糖組分合并收集后，進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

1.3.2.2 DEAE-52離子交換柱層析分離

將2.5g/L IPS溶液加載于DEAE-52離子交換層析柱(2.3cm×50cm)，依次用蒸餾水，0.1～0.5mol/L NaCl，0.1、0.5、1.0mol/L NaOH進(jìn)行洗脫，每管收集3mL，流速為1.5mL/min，以硫酸-蒽酮法檢測(cè)多糖，直至檢測(cè)不出多糖組分，換用下一種洗脫液。多糖組分合并收集后，進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。其中，用N aC l和NaOH溶液進(jìn)行洗脫所收集餾分經(jīng)透析后，進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

1.3.3 IEPS的Sephadex G-100凝膠柱層析分離

將5g/L IEPS水溶液加入到Sephadex G-100層析柱(2.3cm×50cm)，采用蒸餾水洗脫，每管收集3mL，流速為1.5mL/min，餾分采用硫酸-蒽酮法檢測(cè)。

1.3.4 IPS和IEPS的抑菌活性

參照文獻(xiàn)[10]檢測(cè)多糖組分對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和變形桿菌4種待測(cè)菌株生長(zhǎng)的影響，多糖組分質(zhì)量濃度均為0.05g/L。

1.3.5 多糖測(cè)定

用蒸餾水溶解粗多糖，取粗多糖水溶液，用Ultrospec 3300 pro紫外-可見分光光度計(jì)在200～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

取適量粗多糖樣品粉末，采用壓片法，用Nexus Euro型紅外光譜儀測(cè)定其紅外光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 IPS的分離及抑菌活性

將IPSA、IPSB和IPSC這3個(gè)組分重新溶解后，在Sephadex G-75凝膠柱層析上的洗脫曲線見圖1。IPSA未得到明顯的分離；IPSB經(jīng)分離，在洗脫體積為27～87mL范圍內(nèi)出現(xiàn)1個(gè)峰；IPSC在洗脫體積為24～39mL以及42～87mL范圍內(nèi)出現(xiàn)2個(gè)洗脫峰。

圖1 IPS分級(jí)沉淀多糖組分經(jīng)Sephadex G-75的洗脫曲線Fig.1 Elution curves of IPSA, IPSB and IPSC on Sephadex G-75 column

IPS經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析分離，共得到2個(gè)組分，即蒸餾水洗脫得到組分IPSⅠ，1.0mol/L NaOH洗脫得到組分IPSⅡ。0.1、0.2、0.3、0.4mol/L和0.5mol/L NaCl以及0.1mol/L和0.5mol/L NaOH洗脫部分未檢測(cè)到多糖(圖2)。

圖2 IPS經(jīng)DEAE-52洗脫曲線Fig. 2 Elution curve of Isochrysis galbana polysaccharides on DEAE-52 column

圖1 、2表明，IPS經(jīng)乙醇分級(jí)沉淀和Sephadex G-75凝膠柱層析未獲得很好的分離，而采用DEAE-52纖維素柱層析獲得較為理想的分離效果。關(guān)于I P S經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析分離獲得的IPSⅠ和IPSⅡ是否為單一組分多糖，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

洗脫液多次富集后，將IPSⅠ和IPSⅡ濃縮(IPSⅡ還需透析)，配制為0.05g/L后進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果見表1。IPS能抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，但對(duì)變形桿菌并無抑制作用。IPSA、IPSB和IPSC組分同樣均能抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，但對(duì)大腸桿菌并未表現(xiàn)出抑制作用；胞內(nèi)粗多糖經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析分離獲得組分IPSⅠ和IPSⅡ，這2個(gè)組分能抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌。

表1 IPS組分的抑菌作用Table 1 Antibacterial activity of intracellular polysaccharides from Isochrysis galbana

2.2 IEPS的分離及抑菌活性

圖3 IEPS經(jīng)Sephadex G-100洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of Isochrysis galbana extracellular polysaccharides on Sephadex G-100 column

圖3 為IEPS在Sephadex G-100凝膠柱層析上的洗脫曲線，獲得3個(gè)組分，即IEPSA、IEPSB和IEPSC。多次富集后，將IEPSA、IEPSB和IEPSC濃縮，配制為0.05g/L后進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，結(jié)果見表2。對(duì)IEPS而言，其對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出抑制作用；當(dāng)IEPS經(jīng)Sephadex G-100柱層析分離后，所獲的IEPSA、IEPSB和 IEPSC這3個(gè)多糖組分僅能抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。

表2 IEPS組分的抑菌作用Table 2 Antibacterial activity of crude extracellular polysaccharides from Isochrysis galbana

2.3 IPS和IEPS的紫外光譜和紅外光譜

圖4 IPS(a)和IEPS(b)的紫外光譜Fig.4 UV spectra of intracellular and crude extracellular polysaccharides from Isochrysis galbana

由圖4可知，無論是IPS，還是IEPS，在260nm (核酸特征吸收)、280nm(蛋白質(zhì)特征吸收)和630nm(色素特征吸收)都沒有吸收，說明IPS和IEPS均不含核酸、游離或裸露的蛋白質(zhì)和色素。在螺旋藻多糖和糖蛋白提純研究中，胡群寶等[11]運(yùn)用紫外光譜分析糖蛋白特征。孟慶勇等[12]也采用紫外光譜掃描來分析江蘺多糖是否含有核酸和蛋白質(zhì)。

圖5 IPS(a)和IEPS(b)的紅外光譜圖的比較Fig.5 IR spectrum comparison between crude extracellular and intracellular polysaccharides from Isochrysis galbana

由圖5可知，IPS和IEPS的紅外光譜比較相似。3700～3100cm-1和 1075～1010cm-1兩處為糖類O—H 和C—O特征吸收峰；在3000～2800cm-1和1550～1200cm-1的吸收峰為C—H伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)；1700～1500cm-1附近的吸收峰為C＝O伸縮振動(dòng)，表明這兩種多糖中均含有酰氨取代基，這與孟慶勇[13]、張塞金[14]等研究結(jié)果相符。兩種粗多糖都在1057cm-1附近有吸收峰，表明是一種以半乳糖為構(gòu)架的分子模式。此外，在糖類環(huán)振動(dòng)吸收區(qū)930～700cm-1，兩種糖在900cm-1附近均有一個(gè)很微弱的吸收峰，是β-吡喃環(huán)C—H變角振動(dòng)。IPS在1377cm-1附近有較強(qiáng)吸收峰，IEPS紅外光譜圖未見吸收峰，這表明IPS含有硫酸取代基，IEPS不含硫酸取代基。

3 討 論

在微藻抗菌研究中，多數(shù)研究集中在微藻脂肪酸的抑菌活性方面[15-20]，而有關(guān)微藻多糖抑菌活性的研究則相對(duì)較少。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)紫球藻和海水小球藻的多糖提取物對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌有抑制作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)IPS和IEPS也具有抑菌活性，前者抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，后者抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)。

為了獲悉球等鞭金藻粗多糖的抑菌機(jī)理，對(duì)IPS和IEPS進(jìn)行了分離。IPS經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析分離，獲得2個(gè)多糖組分：IPSⅠ和IPSⅡ；IPES經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析分離，獲得3個(gè)多糖組分：IEPSA、IEPSB和IEPSC?；钚詸z測(cè)表明，IPSⅠ和IPSⅡ抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)；I E P S A、IEPSB和IEPSC抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。通過一系列分離，發(fā)現(xiàn)多糖分離組分的抑菌活性有所改變(主要是抑菌活性的目標(biāo)菌株有所減少)，但仍具有抑菌活性，且抑菌活性與粗多糖相當(dāng)，這個(gè)結(jié)果對(duì)于進(jìn)行多糖的進(jìn)一步純化研究具有重要意義。

同時(shí)，比較發(fā)現(xiàn)IPS和IEPS的抑菌活性有所不同，筆者認(rèn)為這與它們的結(jié)構(gòu)有關(guān)。通過紅外光譜測(cè)定，發(fā)現(xiàn)IPS和IEPS結(jié)構(gòu)類似，以半乳糖為構(gòu)架，均含有酰氨取代基，但不同之處在于，后者不含硫酸取代基，這很可能是二者抑菌活性差異的主要原因。張塞金等[14]認(rèn)為IPS不含硫酸取代基，與本結(jié)果不同。已有研究表明，微藻多糖的生物活性和生理功能主要來自于其所含的氨基和硫酸官能團(tuán)[22-23]，因此，相比而言，IPS可能更具有應(yīng)用價(jià)值。紫外光譜表明，IPS和IEPS均不含核酸、游離或裸露的蛋白質(zhì)和色素，這就排除了由微藻蛋白質(zhì)組分可能引起的抑菌作用。

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Separation and Purification of Intracellular and Extracellular Polysaccharides from Isochrysis galbana and Their Antimicrobial Activity

SUN Ying-ying，ZHOU Bao，XU Shen-zhen，LI Wen-hao，YAN Bin-lun*
(Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Two crude polysaccharides, intracellular polysaccharide (IPS) and extracellular polysaccharide (EPS), were isolated from the cells and culture supernatant of Isochrysis galbana through hot-water extraction. The separation and purification of IPS and EPS, and their antimicrobial activities against Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Proteus sp. were investigate, respectively. IPS was separated by ethanol-precipitation and purified by Sephadex G-75 gel chromatography, or by DEAE-52 column chromatography, while EPS was fractionated by Sephadex G-100 gel filtration chromatography. Finally, IPS and EPS were analyzed by UV and IR spectroscopy. The results indicated that: 1) IPS could inhibit the growth of Escherichia coli, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. EPS could inhibit the growth of Escherichia coli and Bacillus subtilis. 2) IPS was separated into two fractions (IPS Ⅰand IPS Ⅱ) by DEAE-52 column chromatography. Both fractions could inhibit the growth of Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus; EPS was separated by Sephadex G-100 gel filtration chromatography into three fractions (EPSA, EPSB and EPSC) with inhibitory activity against the growth of Escherichia coli; 3) The IR and UV spectra of IPS and EPS showed no ester protein, nucleic acid or pigment. Typical absorption curves of IPS and EPS revealed galactose frame with pyranglycoside linkage, while EPS did not exhibit sulfate radicals in the sugar linkage.

Isochrysis galbana；intracellular polysaccharide；extracellular polysaccharide separation and purification；antibacterial activity

Q949.6

A

1002-6630(2012)11-0137-05

2011-05-12

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目(2006BAD09A01)；連云港市工業(yè)攻關(guān)科技計(jì)劃項(xiàng)目(CG0803-1)；淮海工學(xué)院人才引進(jìn)科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(KQ08001)

孫穎穎(1978—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ笊こ獭-mail：syy-999@163.com

*通信作者：閻斌倫(1962—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槲r蟹類增養(yǎng)殖學(xué)。E-mail：yanbinlun@yahoo.com.cn