于麗娜，高俊安，楊慶利,*，孫 杰，畢 潔，張初署，劉少芳

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.山東世紀春食品有限公司，山東 臨沂 276400)

不同處理條件對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響

于麗娜1，高俊安2，楊慶利1,*，孫 杰1，畢 潔1，張初署1，劉少芳1

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.山東世紀春食品有限公司，山東 臨沂 276400)

以花生蛋白粉為原料，采用Viscozyme L預水解，Alcalase水解法制備花生抗氧化肽。通過7種不同的處理條件(加熱、食品添加劑、防腐劑、金屬離子、殺菌、調(diào)pH值、低溫)對花生抗氧化肽的4種體外抗氧化指標(清除DPPH自由基、還原力、鐵離子螯合力、抗脂質(zhì)體過氧化能力)進行研究。結(jié)果顯示：加熱處理和添加食品防腐劑有利于提高抗氧化肽的抗氧化活性；添加酒石酸、檸檬酸對抗氧化活性有較大影響，而添加氯化鈉和蔗糖后對抗氧化活性影響??；添加銅離子對抗氧化活性影響較大；各種殺菌工藝有利于清除DPPH自由基、還原力、鐵離子螯合力，但卻降低脂質(zhì)過氧化抑制率；堿性pH值條件有利于提高抗氧化肽的還原力、鐵離子螯合力和脂質(zhì)過氧化抑制力，酸性pH值條件不利于鐵離子螯合力和脂質(zhì)過氧化抑制力；低溫處理降低抗氧化肽抗氧化活性。

Viscozyme L；Alcalase；花生抗氧化肽；不同處理條件；抗氧化活性

食品中脂質(zhì)易發(fā)生過氧化反應，從而生成一系列過氧化產(chǎn)物，它們破壞食品的營養(yǎng)價值，縮短食品的貨架期，甚至引起“三高”等現(xiàn)代文明病[1]，因此，通常使用抗氧化劑來抑制脂質(zhì)的過氧化作用。目前，使用的抗氧化劑有兩大類：天然抗氧化劑和合成抗氧化劑。近年來，大多數(shù)合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)已經(jīng)被證實對人體肝、脾、肺有毒害作用，并具有蓄積性致癌作用，一些國家已經(jīng)禁止或限制應用在食品中[2]。于是，天然抗氧化劑如抗壞血酸、茶多酚、茶多糖、原花青素、類黃酮、白藜蘆醇、水溶性膳食纖維、抗氧化肽等成為食品科學、食品化學、生化營養(yǎng)學、流行病學、預防醫(yī)學等學科研究的熱點[3-5]。其中，抗氧化肽屬于蛋白質(zhì)類物質(zhì)，除了具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化活性外，還能賦予食品額外的營養(yǎng)價值和功能性質(zhì)，它有望開發(fā)成為新型的功能食品原料[6]。

抗氧化肽應用到食品體系中，其抗氧化活性就要受到食品加工方式、貯運條件、成分、添加劑、酸堿性、包裝材料等的影響，有必要研究在這些條件下的其體外抗氧化活性。本實驗運用植物復合水解酶Viscozyme L預水解花生蛋白粉，再應用堿性蛋白酶Alcalase水解法制備花生抗氧化肽。采用4類體外抗氧化活性實驗[7]：清除DPPH自由基、還原力、鐵離子螯合力、抗脂質(zhì)體過氧化，研究花生抗氧化肽在加熱處理、食品添加劑、食品防腐劑、金屬離子、殺菌工藝、調(diào)pH值、低溫等條件下的抗氧化活性的變化情況，旨在為花生抗氧化肽作為功能食品原料應用到食品中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低變性脫脂花生蛋白粉 山東天申生物蛋白有限公司。

Viscozyme L (100FBG/g)、Alcalase 2.4L(2×105U/g)丹麥Novozyme公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、菲洛嗪(Ferrozine)、L-α-磷脂酰膽堿(大豆提取)、L-抗壞血酸 美國Sigma公司；FeCl3、K3Fe(CN)6、三氯乙酸(TCA)、FeCl2、硫代巴比妥酸(TBA)、HCl均為分析純 上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

FD-1C-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；SHA-B雙功能恒溫水浴振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機 日本Hitachi公司。

1.3 花生抗氧化肽制備工藝

花生蛋白粉加入600mL蒸餾水，超聲溶解30min，用0.5mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值到5.00，加入Viscozyme L酶液2.4mL，45℃恒溫水浴振蕩器中酶解120min。反應結(jié)束后，90℃水浴滅酶20min。用0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.20，加入Alcalase酶液9.6mL，50℃恒溫水浴振蕩器中酶解94min。反應結(jié)束后，100℃水浴滅酶10min。在20℃條件下，以4500r/min離心10min，上清液在冷凍干燥機中凍干，保存到-20℃冰箱中，備用。

1.47 種不同處理條件的實驗方法

花生抗氧化肽溶液分別進行以下操作：1)加熱處理：20、40、60、80、100℃的水浴中分別靜置30min；2)添加食品添加劑：不添加任何添加劑、1g/100mL氯化鈉、4g/100mL蔗糖、8g/100mL葡萄糖、0.2g/100mL檸檬酸、0.2g/100mL酒石酸；3)添加食品防腐劑：不添加任何防腐劑、分別添加0.001g/100mL苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈣和焦亞硫酸鈉；4)添加金屬離子：不添加任何金屬鹽、分別添加0.001g/100mL硫酸鉀、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鋅、硫酸銅；5)不同殺菌工藝：加入8g/100mL葡萄糖、0.1g/100mL檸檬酸和0.1g/100mL酒石酸后做以下處理：不進行任何處理；微波滅菌：以微波功率800W、100℃、5min；巴氏滅菌：63℃水浴中恒溫30min；煮沸滅菌：100℃水浴中恒溫10min；高溫短時殺菌：11 0℃油浴中恒溫1min；高壓蒸汽滅菌：高壓滅菌鍋121℃、0.1MPa、加熱15min；6)不同 pH值：分別用0.5mol/L鹽酸溶液或0.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至3、5、7、9、11；7)低溫處理：分別在室溫、4、-20℃條件下靜置24h；各種操作結(jié)束后測定4個抗氧化活性(DPPH自由基清除率、還原力、鐵離子螯合率、抗脂質(zhì)體過氧化活性)指標。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 DPPH自由基清除率的測定[8]

加入2mL樣品和2mL DPPH無水乙醇溶液(2.5mmol/L)，混合均勻后反應20min，3000r/min離心10min，上清液在517nm波長處測吸光度，記為Ai。DPPH自由基清除率按式(1)計算。

式中：Aj為加入2mL樣品和2mL無水乙醇時測定的吸光度；A0為加入2mL DPPH無水乙醇溶液(2.5mmol/L)和2mL蒸餾水時測定的吸光度。

1.5.2 還原力的測定[9]

取1mL樣品液加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和1g/100mL K3Fe(CN)6溶液各2.5mL，50℃水浴20min，加入2.5mL 10g/100mL消TCA溶液，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL加入2.5mL蒸餾水和0.5mL的0.1g/100mL FeCl3溶液，靜置10min。以參比液調(diào)節(jié)零點，在700nm波長處測定吸光度。

1.5.3 鐵離子螯合率的測定[10]

取1mL樣品加入2.7mL去離子水和0.1mL FeCl2溶液(2mmol/L)，混勻后加入0.2mL Ferrozine(5mmol/L)，靜置10min。在562nm波長處測定吸光度(A)。按公式(2)計算鐵離子螯合率。

式中： A0為空白對照組即以1mL雙蒸水代替樣品的吸光度。

1.5.4 脂質(zhì)過氧化抑制率的測定[11]

取1.0mL L-α-磷脂酰膽堿溶液、1.0mL 0.4mmol/L FeCl3溶液、1.0mL 0.4mmol/L L-抗壞血酸溶液和1.0mL樣品，混勻后37℃水浴60min(避光)，加入2.0mL TCA-TBAHCl混合液(15g的TCA、0.375g TBA、2.1mL濃鹽酸依次序放入100mL蒸餾水中，混合均勻)，95℃水浴15min，3000r/min離心10min，取上清液在535nm波長處測吸光度(A)。對脂質(zhì)體過氧化的抑制率按式(3)計算。

式中：A0為空白對照組即以1mL蒸餾水代替樣品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱處理對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響

圖1 加熱處理對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of heat treatment on antioxidant activity of peanut antioxidant peptide

由圖1a可知，DPPH自由基清除率隨溫度的升高呈先不變后增加的趨勢，100℃加熱處理的抗氧化肽有最大的清除率?？寡趸牡目寡趸钚耘c3類氨基酸(疏水性氨基酸、抗氧化性氨基酸和酸性氨基酸)及其空間構(gòu)象有關(guān)[12]。經(jīng)過加熱處理，尤其是高溫處理后，抗氧化肽的空間構(gòu)象可能改變，使得上述3類氨基酸易與DPPH自由基接觸，從而提供較多的電子與DPPH自由基單電子配對，則DPPH自由基清除率增加。還原力能用來衡量抗氧化物質(zhì)供電子能力的強弱[13]。圖1b顯示，經(jīng)過80℃和100℃加熱處理的抗氧化肽的還原力大于20℃處理的，這也是因為高溫處理改變了抗氧化肽的空間構(gòu)象，使得供電子能力增加導致還原能力增大。圖1c顯示，40～100℃加熱處理的鐵離子螯合率都遠大于20℃處理的螯合率。這是因為加熱處理后抗氧化肽的構(gòu)象改變，使得抗氧化性氨基酸組氨酸容易與反應體系中的Fe2+結(jié)合，組氨酸上的α-氨基和羧基與Fe2+形成五元環(huán)，α-氨基和咪唑基與Fe2+形成六元環(huán)，羧基和咪唑基與Fe2+形成七元環(huán)[14]，導致反應體系中的Fe2+減少，則螯合率增加。圖1d顯示，隨著溫度的升高，抑制率呈直線下降的趨勢。加熱處理改變了抗氧化肽的空間構(gòu)象，使其不能及時的清除反應體系中的自由基。而脂質(zhì)過氧化反應是自由基連鎖反應，只需少數(shù)幾個自由基引發(fā)劑就能導致數(shù)以千計的多不飽和脂肪酸分子發(fā)生反應[15]，因此，加熱處理條件下，對脂質(zhì)過氧化的抑制率減小。

2.2 食品添加劑對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響

由圖2a可知，加入葡萄糖、酒石酸、氯化鈉和蔗糖后，DPPH自由基清除率略有減小，但加入檸檬酸后，DPPH自由基清除率顯著減小，僅為對照樣品的3.1%。可能原因是檸檬酸是一種較強的有機酸，它的加入會影響花生抗氧化肽的供電子能力，導致清除DPPH自由基效果下降。同理，由圖2b可知，加入檸檬酸的還原力減小，而加入其他添加劑的還原力，葡萄糖沒有顯著改變還原力，其他添加劑使還原力增大。其中，加入酒石酸使樣品還原力顯著增加，是對照樣品的2.6倍，主要因為酒石酸是一種還原劑，它可以大幅度提高反應體系的還原能力。由圖2c可知，加入氯化鈉和蔗糖的鐵離子螯合率變化不大；加入檸檬酸的螯合率顯著增加，可能是因為檸檬酸的3個羧基有利于抗氧化肽中組氨酸與Fe2+形成五元環(huán)和七元環(huán)所致；加入葡萄糖的螯合率略微減??；而加入酒石酸的樣品失去對鐵離子螯合能力，酒石酸能與多種金屬離子絡合，在反應體系中它與Fe2+絡合作用強于抗氧化肽與Fe2+螯合作用，所以，抗氧化肽失去與Fe2+螯合的機會，導致沒有螯合作用。由圖2d可知，加入葡萄糖、檸檬酸、氯化鈉后，抑制率增大；加入蔗糖后抑制率減小；加入酒石酸后，抗氧化肽對脂質(zhì)過氧化沒有抑制效果。

圖2 食品添加劑對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of food additive on antioxidant activity of peanut antioxidant peptide

2.3 食品防腐劑對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響

圖3 食品防腐劑對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of food preservative on antioxidant activity of peanut antioxidant peptide

由圖3可知，DPPH自由基清除率和還原力結(jié)果(圖3a和3b)顯示，加入5種防腐劑后DPPH自由基清除率和還原力都增加，其中，加入焦亞硫酸鈉的還原力增加最明顯，其吸光度是不加任何防腐劑樣品的3.6倍。原因是焦亞硫酸鈉是一種還原劑，它本身能促進反應體系的吸光度增大。加入5種防腐劑后，抗氧化肽對鐵離子螯合率都減小(圖3c)。抑制脂質(zhì)過氧化反應結(jié)果(圖3d)中，除了加入山梨酸鉀的抗氧化肽對脂質(zhì)過氧化抑制率減小外，其余都增大。

2.4 金屬離子對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響

圖4 金屬離子對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of metal ion on antioxidant activity of peanut antioxidant peptide

由圖4可知，DPPH自由基清除率(圖4a)和還原力(圖4b)在加入金屬離子后，除了加入硫酸鋅的還原力明顯減小外，其余各組實驗結(jié)果變化不大，說明金屬離子對這兩種抗氧化活性沒有影響。鐵離子螯合率結(jié)果(圖4 c)中，加入氯化鈣、硝酸鎂、硫酸鋅后螯合率下降；加入硫酸鉀和硫酸銅后螯合率增大，且加入硫酸銅后螯合率增大最顯著，是對照樣品螯合率的2.3倍，可能原因是硫酸銅的水溶液呈弱酸性，使得抗氧化肽的組氨酸殘基的咪唑基接受質(zhì)子，易與Fe2+形成六元環(huán)和七元環(huán)，從而提高對Fe2+螯合能力。抑制脂質(zhì)過氧化結(jié)果顯示(圖4d)，除了加入硫酸鉀的抑制率減小外，加入其他金屬離子的抑制率都增大，其中，加入硫酸銅后抑制率增大最顯著，是對照樣品抑制率的3.7倍。

2.5 不同殺菌工藝對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響

圖5 不同殺菌工藝對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of sterilization on antioxidant activity of peanut antioxidant peptide

由圖5a可知，除了高壓蒸汽滅菌的樣品清除率沒有變化外，其他殺菌工藝的清除率都有增加，其中，微波滅菌增大最多。其原因是5種殺菌工藝都有不同程度的加熱過程，抗氧化肽在加熱處理后空間構(gòu)象會有改變，同2.1節(jié)結(jié)果一樣，使得疏水性氨基酸、抗氧化性氨基酸和酸性氨基酸提供較多的電子與DPPH自由基的氮原子的單電子配對，從而增加清除率。由圖5b可知，巴氏滅菌、煮沸滅菌和高溫短時殺菌工藝樣品的還原力都略有減小，而微波滅菌和高壓蒸汽滅菌樣品的還原力均增大，高壓蒸汽滅菌樣品的還原力是對照組品的2.3倍，可能是樣品經(jīng)過高壓蒸汽滅菌處理后部分抗氧化肽發(fā)生美拉德反應，而美拉德反應產(chǎn)物具有還原力，致使反應體系還原力大幅增加。由圖5c可知，5種殺菌工藝的樣品的鐵離子螯合率都大于對照樣品，其中，煮沸滅菌樣品的螯合率是對照組樣品的1.6倍。由圖5d可知，5種殺菌工藝樣品的抑制率都減小，其中，微波滅菌樣品的抑制率最小，僅為不經(jīng)過殺菌處理樣品的16.7%。經(jīng)過5種殺菌工藝處理，抗氧化肽的空間構(gòu)象改變而不能及時清除反應體系中的自由基，導致對脂質(zhì)過氧化抑制能力下降，這個結(jié)果與2.1節(jié)中一致。

2.6 pH值對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響

圖6 pH值對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of pH on antioxidant activity of peanut antioxidant peptide

由圖6a可知，pH3～7的樣品對DPPH自由基清除效果較好，堿性條件下清除率較小。由圖6b可知，隨著pH值的增加，樣品還原力呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，總體來看，堿性條件下樣品的還原力較大。由圖6c和6d可知，酸性pH值條件下，樣品失去這兩種抗氧化能力，而中性和堿性條件下較好，尤其在堿性條件下，樣品的鐵離子螯合率和脂質(zhì)過氧化抑制率都較大?？赡茉蚴侨芤旱膒H值會影響抗氧化肽的空間構(gòu)象，酸性pH值使抗氧化肽的極性氨基酸暴露出來，阻礙疏水性氨基酸和抗氧化性氨基酸發(fā)揮抗氧化活性，而堿性pH值有助于上述氨基酸殘基的抗氧化活性。因此，堿性pH值條件下，抗氧化肽的還原力、螯合金屬離子能力和抑制脂質(zhì)過氧化能力都較好。

2.7 低溫處理對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響

圖7 低溫處理對花生抗氧化肽抗氧化活性的影響Fig.7 Effect of low temperature treatment on antioxidant activity of peanut antioxidant peptide

由圖7可知，低溫處理后，樣品除了對DPPH自由基清除率沒有變化外，其余3種抗氧化能力均減少。4℃處理的抗氧化肽相對于常溫下的樣品的還原力減小8.6%、鐵離子螯合率減小34.5%、脂質(zhì)過氧化抑制率減小24.4%。-20℃處理的這3個值分別減小13.1%、42.4%和22.6%。總體來看，-20℃處理對抗氧化肽抗氧化活性的影響要大于4℃的?？赡茉蚴堑蜏靥幚?，尤其是冷凍狀態(tài)下，抗氧化肽分子周圍的水分子不斷凍結(jié)，使得抗氧化肽的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，部分極性基團暴露在周圍環(huán)境中，從而阻礙了疏水性氨基酸、抗氧化性氨基酸和酸性氨基酸發(fā)揮抗氧化活性，導致還原力、金屬離子螯合力和抑制脂質(zhì)過氧化能力下降。

3 結(jié) 論

以低變性花生蛋白粉為原料，超聲波分散溶解和Viscozyme L水解蛋白粉后，采用Alcalase水解制備花生抗氧化肽。研究了加熱處理、食品添加劑、食品防腐劑、金屬離子、殺菌工藝、pH值和低溫處理7個條件下花生抗氧化肽抗氧化活性的變化情況。加熱處理有利于提高抗氧化肽的抗氧化活性(DPPH自由基清除率、還原力和鐵離子螯合率增大)。添加酒石酸、檸檬酸對抗氧化活性有較大影響(添加酒石酸的還原力增加顯著，螯合能力和抑制脂質(zhì)過氧化能力喪失；添加檸檬酸的鐵離子螯合率增加顯著，DPPH自由基清除率和還原力下降顯著)，添加氯化鈉和蔗糖的抗氧化活性沒變化。添加食品防腐劑可提高抗氧化活性(DPPH自由基清除率、還原力和脂質(zhì)過氧化抑制率增大)。添加銅離子對抗氧化活性影響較大(鐵離子螯合率和脂質(zhì)過氧化抑制率顯著增大)。各種殺菌工藝能降低脂質(zhì)過氧化抑制率。除了DPPH自由基清除活性外，堿性pH值條件有利于提高其他抗氧化活性，而酸性pH值條件不利于鐵離子螯合和抑制脂質(zhì)過氧化活性。低溫處理能降低抗氧化肽抗氧化活性。

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Effects of Different Treatment Conditions on Antioxidant Activity of Peanut Antioxidant Peptide

YU Li-na1，GAO Jun-an2，YANG Qing-li1,*，SUN Jie1，BI jie1，ZHANG Chu-shu1，LIU Shao-fang1
(1. Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China；2. Shandong Shijichun Foodstuff Co. Ltd., Linyi 276400, China)

Peanut antioxidant peptide was prepared by sequential hydrolysis of peanut protein powder with Viscozyme L followed by alcalase. The effects of heat, food additive, preservative, metal ion, sterilization, pH and low temperature treatment on antioxidant properties in vitro such as DPPH radical scavenging activity, reducing power, ferrous ion chelating ability and antilipid peroxidation were investigated. The results indicated that heat treatment and food preservative treatment were beneficial for increasing the antioxidant activity of peanut antioxidant peptide. The addition of tartaric acid or citric acid had considerable impact on the antioxidant activity of peanut antioxidant peptide. Nevertheless, the antioxidant activity remained at a stable level in the presence of sodium chloride or sucrose. Copper ion also had an obvious effect on the antioxidant activity of peanut antioxidant peptide. Various sterilization processes were beneficial to the scavenging of DPPH free radicals, reducing power, ferrous ion chelating capacity, but could reduce the inhibitory rate of lipid peroxidation. The reducing power, ferrous ion chelating capacity and anti-lipid peroxidation could be enhanced under alkaline conditions, whereas acidic conditions could reduce the ferrous ion chelating capacity and anti-lipid peroxidation. Low temperature treatment could reduce the antioxidant activity of peanut antioxidant peptide.

Viscozyme L；Alcalase；peanut antioxidant peptide；different treatment conditions；antioxidant activity

TS201.1；TS229

A

1002-6630(2012)11-0104-07

2011-06-21

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BAD97B04)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(nycytx-19)；青島市公共領(lǐng)域科技支撐計劃項目(09-1-1-84-nsh)

于麗娜(1974—)，女，助理研究員，博士，研究方向為花生功能保健食品的開發(fā)與應用。E-mail：lhtyln0626@yahoo.com.cn

*通信作者：楊慶利(1977—)，男，副研究員，博士，研究方向為花生綜合利用。E-mail：rice407@163.com