鄭 捷，劉學(xué)勤，柳亞靜，劉東岳，曹 蓓，石龍貴，劉安軍

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

雞肉味風(fēng)味基料中蛋白黑素的初步分析

鄭 捷，劉學(xué)勤，柳亞靜，劉東岳，曹 蓓，石龍貴，劉安軍

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

利用雞骨架酶解液為原料，通過(guò)美拉德反應(yīng)制備雞肉味風(fēng)味基料。通過(guò)大小排阻高壓液相色譜對(duì)雞肉味風(fēng)味基料中的蛋白黑素進(jìn)行分子質(zhì)量(Mw)分析，發(fā)現(xiàn)其大小約為11561.1D；對(duì)使用0.2mol/L和0.5mol/L NaCl溶液洗脫出的蛋白黑素進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，鑒定出部分C-H、C＝O以及C-N等吸收峰，說(shuō)明蛋白黑素是一類復(fù)雜的有機(jī)化合物，可能由氨基酸復(fù)合物聚合、交聯(lián)和美拉德反應(yīng)的早期階段的糖降解產(chǎn)物形成的，具體結(jié)構(gòu)仍需深入研究。

雞骨架；酶解物；蛋白黑素；大小排阻高壓液相色譜；傅里葉變換紅外光譜

蛋白黑素是由羰基化合物(一般指糖類)與帶有自由氨基的含氮化合物(如氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等)之間發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)物通過(guò)進(jìn)一步環(huán)化、脫水、逆縮、重排、異構(gòu)化、縮合而形成的一種褐色物質(zhì)，也稱類黑精[1-2]；蛋白黑素具有抗氧化[3-4]、抗菌[5]、降糖、降壓[6]等生理功能，且其功能性已得到初步驗(yàn)證。蛋白黑素結(jié)構(gòu)復(fù)雜、聚合度不等，是一種復(fù)雜的聚合物[7]。在不同反應(yīng)條件下，不同反應(yīng)物反應(yīng)得到的蛋白黑素的組成成分與結(jié)構(gòu)均存在差異。目前，人們也逐漸開(kāi)始對(duì)蛋白黑素的具體組成、分子結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理展開(kāi)深入研究。Mundt等[8]對(duì)蛋白黑素的組成成分進(jìn)行了比較研究，結(jié)果顯示，蛋白黑素主要由降解反應(yīng)的產(chǎn)物氨基酸、糖結(jié)構(gòu)片斷、醛等部分組成。Martins等[9]的研究表明，蛋白黑素的形成主要有以下3種途徑：1)低分子質(zhì)量的有色物質(zhì)以及低分子質(zhì)量的發(fā)色物質(zhì)交聯(lián)蛋白質(zhì)中Lys和Arg中游離氨基基團(tuán)；2)呋喃或吡咯通過(guò)縮聚反應(yīng)、氨基酸復(fù)合物聚合、交聯(lián)；3)美拉德反應(yīng)的早期階段的糖降解產(chǎn)物。

在食品加工過(guò)程中，蛋白黑素與相關(guān)食品的營(yíng)養(yǎng)有密切關(guān)系，其廣泛分布于咖啡、可可、面包、麥芽、蜂蜜等食品中，與人類關(guān)系密切。但在熱解蛋白質(zhì)和氨基酸過(guò)程中，有機(jī)體突變物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)增加了對(duì)這些食物安全性的關(guān)注。Taylor等[10]應(yīng)用Ames、Vitotox和微核實(shí)驗(yàn)對(duì)Glu-Lys模型體系產(chǎn)生蛋白黑素的基因毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)表明，在正常食用濃度范圍，食品中蛋白黑素?zé)o基因毒性，高濃度的低分子質(zhì)量的蛋白黑素具有毒性。Borrelli等[11]研究發(fā)現(xiàn)可溶性的蛋白黑素有較強(qiáng)的氧化能力，對(duì)Caco-2細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

本實(shí)驗(yàn)使用大小排阻高壓液相色譜對(duì)雞肉味風(fēng)味基料中蛋白黑素的分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，并使用傅里葉變換紅外光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，初步探索雞肉味風(fēng)味基料中蛋白黑素的分子結(jié)構(gòu)，為今后進(jìn)一步就其結(jié)構(gòu)的研究提供有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞骨架 大成(天津)集團(tuán)；Flavourzyme諾維信復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(1.0×105U/g) 、Protamex蛋白酶(1.2× 105U/g) 丹麥(中國(guó))諾維信公司；中低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(生化試劑) 美國(guó)Sigma公司；丙氨酸(生化試劑)天津顥洋生物制品有限公司；鹽酸(分析純) 天津文達(dá)稀貴試劑化工廠；氫氧化鈉(分析純) 天津市北方化玻購(gòu)銷中心；氯化鈉、葡萄糖等均為分析純 天津江天化工有限公司；各種調(diào)味料 天津市塘沽區(qū)樂(lè)購(gòu)超市。

1.2 儀器與設(shè)備

ESJ205-4型電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司；PHS-3B型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；TJS12-H絞肉機(jī) 廣東恒聯(lián)食品機(jī)械有限公司；膠體磨 廊坊通用機(jī)械制造有限公司；FJ-200型高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；LD4-40型低速大容量離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；Waters 600高效液相分析儀(配有配2487紫外檢測(cè)器和M32工作站) 島津(香港)有限公司；Vector 22傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

取一定量的新鮮雞骨架，除皮及油脂，用絞肉機(jī)將雞骨架充分絞碎，將其置于120℃、0.1MPa高壓加熱處理20min；加適量的蒸餾水于膠體磨中研磨雞骨顆粒，制得雞骨糜。

1.3.2 雞骨架酶解液的制備

向上述雞骨糜中加入蒸餾水，高速均質(zhì)混勻配制成25%的雞骨懸浮液，用3mol/L HCl或NaOH調(diào)溶液pH值至蛋白酶的最適pH值。置于500mL的燒杯中，采用恒溫水浴鍋維持酶的最適反應(yīng)溫度55℃，并保證均勻受熱。加入600U/g Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶和360U/g Protamex蛋白酶(以底物蛋白計(jì)算)水解反應(yīng)3h，然后在95℃條件下加熱10min使酶失活終止反應(yīng)。水解液離心后，保留上清液以備用。

1.3.3 雞肉味風(fēng)味基料的制備

取40g的雞骨架蛋白酶解液，加入HAP 50g(水解蛋白酶)、1.0g L-半胱氨酸鹽酸鹽、2g味精、0.8g硫胺素、0.5g食鹽、2g丙氨酸、1g木糖、0.5g葡萄糖，120℃進(jìn)行美拉德反應(yīng)20min制備雞肉味風(fēng)味基料。

1.3.4 雞肉味風(fēng)味基料中蛋白黑素的分析

1.3.4.1 低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

色譜條件[12]：Waters 600 高效液相色譜儀(配2487紫外檢測(cè)器和M32工作站)；TSKgelG4000PWXL 色譜柱(300mm×7.8mm，10μm)；流動(dòng)相：0.2mol/L磷酸鹽緩沖液；UV220nm檢測(cè)器；流速：0.6mL/min；

標(biāo)準(zhǔn)品：兔磷酸化酶B(Mw97.4kD)、牛血清白蛋白(Mw66.2kD)、兔肌動(dòng)蛋白(Mw43kD)、牛碳酸酐酶(Mw31kD)、胰蛋白酶抑制劑(Mw20.1kD)、雞蛋清溶菌酶(Mw14.4kD)。

1.3.4.2 雞肉味風(fēng)味基料中蛋白黑素的分離

對(duì)蛋白黑素分離、分析的方法主要有等電聚焦、金屬離子親和色譜、凝集素親和層析色譜等方法[13]。目前，在蛋白黑素的制備方面普遍采用的方法是：將美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物 MRPs通過(guò)透析、Sephadex、超濾等技術(shù)進(jìn)行分離，即可得到不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍的蛋白黑素。

本實(shí)驗(yàn)將雞肉風(fēng)味基料置于3000D的透析袋中，流水透析48h，然后用DEAE-Sephadex A-25凝膠柱分離，分別用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L NaCl溶液洗脫[14-15]。

1.3.4.3 大小排阻高壓液相色譜(HPSEC)分析蛋白黑素分子質(zhì)量

大小排阻高壓液相色譜條件同1.3.4.1節(jié)中所述；樣品制備：樣品用微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后，吸取15μL進(jìn)樣。

1.3.4.4 傅里葉變換紅外光譜初測(cè)結(jié)構(gòu)

將分離出的蛋白黑素凍干后與溴化鉀混勻壓片，置于Vector 22傅里葉變換紅外光譜儀中進(jìn)行分析。分辨率：4cm-1，掃描次數(shù)：16。

2 結(jié)果與分析

2.1 低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量校正曲線的確定

低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白大小排阻高壓液相分子凝膠色譜圖如圖1所示，分別選取標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間(χ)與分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值(lgMw)為橫縱坐標(biāo)作出分子質(zhì)量校正曲線，并得出分子質(zhì)量校正曲線方程為：lg Mw＝-0.135X＋6.789(R2＝0.943)。

圖1 低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白高壓液相分子凝膠色譜圖Fig.1 HPSEC of peptide standards with low molecular weight

2.2 蛋白黑素分子質(zhì)量的確定

采用DEAE-Sephadex A-25凝膠柱對(duì)雞肉風(fēng)味基料進(jìn)行分離(圖2)，用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液洗脫出蛋白黑素。對(duì)5種蛋白黑素用大小排阻高壓液相色譜進(jìn)行分子質(zhì)量分析，分子質(zhì)量經(jīng)校正曲線方程計(jì)算，發(fā)現(xiàn)其分布在同一范圍內(nèi)，約為11561.1D。DEAESephadex A-25凝膠顆粒大小為4～120μm，適用于分離小蛋白及巨大分子，5種濃度NaCl洗脫液洗脫出同樣分子質(zhì)量的樣品，可能是由于樣品分子質(zhì)量不在凝膠洗脫范圍內(nèi)，因此僅以其離子強(qiáng)度大小被分離。

圖2 蛋白黑素高壓液相分子凝膠色譜圖Fig.2 HPSEC of melanoidin sample

2.3 蛋白黑素結(jié)構(gòu)的紅外光譜初步測(cè)定

選取0.2mol/L和0.5mol/L NaCl溶液洗脫出蛋白黑素，對(duì)其進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，紅外光譜圖見(jiàn)圖3。用0.2mol/L NaCl溶液洗脫出的蛋白黑素在3080cm-1處可能存在＝C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，也可能是C-X吸收振動(dòng)峰(X＝O、N、C、S)。3306、2977、2836cm-1處可能存在C-X吸收振動(dòng)峰。1651cm-1處存在不對(duì)稱烯烴C＝C伸縮振動(dòng)吸收峰，980cm-1處存在＝C-H面外彎曲振動(dòng)吸收峰，3306cm-1處存在末端炔烴＝C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1723cm-1處存在C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰。0.5mol/L NaCl溶液洗脫出的蛋白黑素在波數(shù)2925cm-1處存在C-H甲基和亞甲基伸縮振動(dòng)吸收峰，1641cm-1處存在不對(duì)稱烯烴C＝C伸縮振動(dòng)吸收峰，928cm-1和858cm-1處存在末端烯烴＝C-H面外彎曲振動(dòng)吸收峰，1384cm-1處存在C-H甲基和亞甲基剪切振動(dòng)吸收峰。

圖3 0.2mol/L(A)和0.5mol/L(B)NaCl溶液洗脫出的蛋白黑素紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of melanoidin eluted by 0.2 mol/L and 0.5 mol/L NaCl solutions

本實(shí)驗(yàn)鑒定出部分C-H、C＝O以及C-N等吸收峰，說(shuō)明蛋白黑素是一類復(fù)雜的化合物，有可能是由氨基酸復(fù)合物聚合、交聯(lián)和美拉德反應(yīng)的早期階段的糖降解產(chǎn)物形成的，其具體結(jié)構(gòu)需進(jìn)一步檢測(cè)才能得出。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)利用DEAE-Sephadex A-25凝膠柱分離雞肉味風(fēng)味基料中的蛋白黑素，并使用大小排阻高壓液相色譜對(duì)其進(jìn)行分子質(zhì)量分析得出其分子質(zhì)量約為11561.1D；對(duì)使用0.2mol/L和0.5mol/L NaCl溶液洗脫出的蛋白黑素進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，鑒定出部分C-H、C＝O以及C-N等吸收峰，說(shuō)明蛋白黑素是一類復(fù)雜的有機(jī)化合物，有可能是由氨基酸復(fù)合物聚合、交聯(lián)和美拉德反應(yīng)的早期階段的糖降解產(chǎn)物形成的，具體結(jié)構(gòu)仍需深入研究。

[1]崔暢, 張永忠, 李文濱. 蛋白黑素的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(8): 517-520.

[2]徐清萍. 食品類黑精的功能、結(jié)構(gòu)及制備研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)釀造, 2008, 27(22): 13-15.

[3]秦禮康, 丁霄霖. 陳窖豆豉粑類黑精組分體外抗氧化活性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(1): 88-92.

[4]DELGADO-ANDRADE C, RUFIAN-HENARES J A, MORALES F J. Assessing the antioxidant activity of melanoidins from coffee brews by different antioxidant methods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(20): 7832-7836.

[5]HIRAMOTO S, ITOH K, SHIZUUCHI S, et al. Melanoidin, a food protein: derived advanced Maillard reaction product, suppresses Helicobacter pylori in vitro and in vivo[J]. Helicobacter, 2004, 9(5): 429-435.

[6]五明紀(jì)春, 陳曉光, 劉宇峰. 大豆豆醬、醬油中褐色色素的生理功能作用[J]. 大豆通報(bào), 2001(1): 28-29.

[7]呂承秀, 王帥, 于曉旭. 類黑精研究進(jìn)展[J]. 糧食與油脂, 2009(12): 45-47.

[8]MUNDT S, WEDZICHA B L. Comparative study of the composition of melanoidins from glucose and maltose[J]. J Agric Food Chem, 2004, 52 (13): 4256-4260.

[9]MARTINS S I F S, van BOEKEL M A J S. Melanoidins extinction coefficient in the glucose/glycine Maillard reaction[J]. Food Chemistry, 2003, 83(1): 135-142.

[10]TAYLOR J L S, DEMYTTENAERE J C R, TEHRANI K A, et al. Genotoxicity of melanoidin fractions derived from a standard glucoseglycine model[J]. Agric Food Chem, 2004, 52(2): 318-323.

[11]BORRELLI R C, MENNELLA C, BARBA F, et al. Characterization of coloured compound sobtained by enzymatic extraction of bakery products [J]. Food and Chemical Toxicology, 2003, 41(10): 1367-1374.

[12]譚斌. Maillard反應(yīng)體系制備熱加工牛肉風(fēng)味基料的研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2005.

[13]MORALES F J, FERNANDEZ-FRAGUAS C, JIMENEZ-PEREZ S. Iron-binding ability of melanoidins from food and model systems[J]. Food Chemistry, 2005, 90(4): 821-827.

[14]CHANG H Y, YANG Xiaolu. Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2000, 64(4): 821-846.

[15]XU Qingping, TAO Wenyi, AO Zonghua. Antioxidant activity of vinegar melanoidins[J]. Food Chemistry, 2007, 102(3): 841-849.

Preliminary Analysis of Melanoidin in Chicken Flavor Matrix

ZHENG Jie，LIU Xue-qin，LIU Ya-jing，LIU Dong-yue，CAO Bei，SHI Long-gui，LIU An-jun
(College of Food Science and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Chicken bone hydrolysate was used to prepare chicken flavor matrix via Maillard reaction in this work. The molecular weight of melanoidin in the prepared flavor matrix was determined to be approximately 11561.1 D by size-exclusion highperformance liquid chromatography(HPSEC). The FT-IR results revealed that melanoidin fractions separated by 0.2 mol/L and 0.5 mol/L NaCl solutions had characteristic absorption peaks of C—H, C＝O and C—N, suggesting that melanoidin in chicken flavor matrix was organic compound formed by polymerization and cross-linking of amino acid mixtures and degraded products in an early stage of Maillard reaction. The structure of melanoidin needs to be further investigated.

chicken bone ；protein hydrolysates；melanoidin；size exclusion high performance liquid chromatography；fourier transform infrared spectroscopy

TS251.94

A

1002-6630(2012)11-0066-04

2011-06-17

天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目(201002090)；天津市科技成果轉(zhuǎn)化及產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)計(jì)劃項(xiàng)目(09ZHXHNC04900)；天津東麗科委科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2010301；2010303)

鄭捷(1972—)，女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品、畜產(chǎn)(副產(chǎn))品高附加值的開(kāi)發(fā)利用及功能性食品。E-mail：jane@tust.edu.cn