王中江，江連洲,2,*，魏冬旭,3，李 楊，王 辰，李 丹,4

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 哈爾濱 150001；4.寧德師范學(xué)院，福建 寧德 352100)

pH值對(duì)大豆分離蛋白構(gòu)象及表面疏水性的影響

王中江1，江連洲1,2,*，魏冬旭1,3，李 楊1，王 辰1，李 丹1,4

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 哈爾濱 150001；4.寧德師范學(xué)院，福建 寧德 352100)

采用Lowery法、ANS熒光探針?lè)āA二色光譜、熒光光譜方法分別對(duì)不同pH值大豆分離蛋白溶解度、表面疏水性、蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：隨著pH值的升高，大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生由β-折疊結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，其Trp殘基所處微環(huán)境極性增強(qiáng)。大豆分離蛋白表面疏水性與溶解度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，同時(shí)大豆分離蛋白表面疏水性也與α-螺旋結(jié)構(gòu)含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

大豆分離蛋白；pH值；表面疏水性；構(gòu)象

在我國(guó)的大豆蛋白質(zhì)市場(chǎng)上，大豆分離蛋白是產(chǎn)量最大的一種產(chǎn)品。目前大豆分離蛋白被廣泛應(yīng)用于食品加工中的各個(gè)領(lǐng)域，這一方面是由于大豆蛋白質(zhì)自身豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而更重要的另一方面是由于大豆分離蛋白具有許多優(yōu)良的功能特性。針對(duì)不同的功能性質(zhì)，大豆分離蛋白被應(yīng)用在不同食品及化工領(lǐng)域，化工及材料工業(yè)主要利用了大豆分離蛋白的表面疏水性質(zhì)。

蛋白質(zhì)是由多種氨基酸相互聯(lián)結(jié)構(gòu)成的具有特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，而維持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要的作用力是疏水基之間的相互作用。疏水作用是一種配位體間非共價(jià)鍵相互作用，它在生物體內(nèi)的許多精細(xì)化學(xué)和物理特性以及對(duì)其反應(yīng)性的研究方面的知識(shí)迄今仍很不完全。一般來(lái)說(shuō)，多數(shù)構(gòu)成蛋白質(zhì)的非極性氨基酸側(cè)鏈分布在分子內(nèi)部形成疏水內(nèi)核，而極性氨基酸分布在表面的親水環(huán)境中。對(duì)于一些已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)表面性質(zhì)的分析表明，一些疏水基團(tuán)也會(huì)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面，使蛋白質(zhì)表面也具有一定的疏水性。疏水作用對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和蛋白質(zhì)功能具有重大意義。由于蛋白質(zhì)是大分子結(jié)構(gòu)，表面疏水性影響分子間的相互作用，因此比整體的疏水性對(duì)蛋白質(zhì)的功能具有更大的影響[1]。蛋白質(zhì)表面疏水性可作為疏水基團(tuán)和極性溶液環(huán)境結(jié)合數(shù)目的指標(biāo)，而疏水基團(tuán)和極性溶液環(huán)境結(jié)合數(shù)目可衡量分子間相互作用的強(qiáng)弱，因而表面疏水性是蛋白質(zhì)一種很重要的表面性質(zhì)。

研究表明，蛋白質(zhì)的表面疏水性不僅與其來(lái)源、加工條件、加工方法等有關(guān)，而且與蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征等密切相關(guān)，包括蛋白質(zhì)的大小、形狀、氨基酸組成及序列及其含量分布、三級(jí)及四級(jí)結(jié)構(gòu)、分子內(nèi)或分子間交聯(lián)等[2-3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)圓二色光譜、熒光光譜檢測(cè)方法，系統(tǒng)研究pH值對(duì)大豆球蛋白表面疏水性和結(jié)構(gòu)的影響，從而可進(jìn)一步探討pH值與大豆蛋白表面疏水性之間的關(guān)系，期望為大豆精深加工及高值化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(東農(nóng)-46號(hào))由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供。大豆粉碎后過(guò)60目篩，用石油醚脫脂，得脫脂大豆粉。

所用試劑最低純度為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

J-815圓二色光譜儀 日本Jasco公司；CR22G高速冷凍離心機(jī)、F-4500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；PHS-3D pH計(jì) 上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白制備工藝流程

脫脂豆粉→ pH8.0堿提→離心→ pH4.5酸沉→溶解→冷凍干燥→成品

工藝條件：用水以料液比1:10(m/V)的比例溶解豆粕，用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，在磁力攪拌下提取3h；然后10000×g離心30min；上清液用2mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，再10000×g離心30min；瀝去上清液，用水洗沉淀3次，加少量的水溶解沉淀，用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0；最后冷凍干燥得到大豆分離蛋白成品(蛋白質(zhì)含量為88.89%)。

1.3.2 不同pH值緩沖液的配制

配制0.01mol/L的pH值為2～6的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，pH值為7～9的Tris-HCl緩沖液，pH10的甘氨酸-HCl緩沖液，pH11和pH12的NaOH-NaH2PO4緩沖液(離子濃度約為0.05mol/L)。

1.3.3 溶解度測(cè)定

稱取100mg蛋白樣品分散于10mL的去離子水中，磁力攪拌30min，然后用1mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值，攪拌30min后離心(12000×g，20min，20℃)。上清液經(jīng)適度稀釋，采用Lowery法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[4]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上清液蛋白質(zhì)量濃度占總蛋白質(zhì)量濃度的百分比表示蛋白質(zhì)的溶解度。

1.3.4 表面疏水性的測(cè)定

采用ANS熒光探針?lè)?。將蛋白質(zhì)樣品溶于0.01mol/L不同緩沖液中，配成10mg/mL的溶液，均質(zhì)1min后8000×g離心20min，取上清液用Lowery法測(cè)定溶液中大豆蛋白的質(zhì)量濃度，然后將上清液稀釋成不同的梯度后，取不同的樣品溶液10ml，分別加入50μL 8mmol/L的ANS溶液，振蕩，靜置10min后測(cè)其熒光強(qiáng)度(FI)。在本實(shí)驗(yàn)中激發(fā)波長(zhǎng)330nm，發(fā)射波長(zhǎng)490nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)作圖，初始段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水值[5-6]。

1.3.5 圓二色光譜分析

采用遠(yuǎn)紫外區(qū)域圓二色光譜用于研究不同pH值對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。準(zhǔn)確稱取一定量的蛋白樣品，溶于不同pH值緩沖液中，蛋白質(zhì)量濃度為0.4mg/mL，室溫下將樣品放置4h。樣品pH值采用高精度的pH酸度計(jì)進(jìn)行監(jiān)控。采用圓二色光譜儀在190～250nm之間掃描，實(shí)驗(yàn)溫度為20℃，樣品池光程為1mm，靈敏度為100mdeg/cm，掃描速度率為100nm/min，分辨率0.1nm，實(shí)驗(yàn)值為5次掃描的均值。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成采用CDPro曲線擬合軟件包，使用的算法為CONTIN/LL，使用的參考蛋白為SMP56，取蛋白平均殘基摩爾質(zhì)量(MRW)為115g/mol，計(jì)算波長(zhǎng)范圍為200～240nm，每個(gè)樣品重復(fù)3次測(cè)定。

1.3.6 熒光光譜分析

采用F-4500型熒光分光光度計(jì)測(cè)定大豆分離蛋白的熒光光譜。蛋白分散于不同pH值緩沖液中，蛋白質(zhì)量濃度為0.2mg/mL，激發(fā)波長(zhǎng)為295nm，發(fā)射光譜范圍為300～400nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5nm，掃描5次。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

用SAS 8.12進(jìn)行相關(guān)分析和方差分析，如果方差分析效應(yīng)顯著，使用Duncan multiple range test進(jìn)行多重比較(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值的大豆分離蛋白溶解度曲線

圖1 不同pH值對(duì)大豆分離蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of pH on solubility of soybean protein isolate

大豆分離蛋白的等電點(diǎn)在4.2～4.6，由圖1可知，大豆分離蛋白的溶解度在4.5附近出現(xiàn)最小值(約為7%)，而在pH4.5兩側(cè)的pH值范圍內(nèi)溶解性均有顯著升高(P＜0.05)，同時(shí)可以看出大豆分離蛋白在強(qiáng)酸及堿性范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的溶解性。

由于工業(yè)上生產(chǎn)大豆分離蛋白的pH值范圍在4～9，因而選取這一區(qū)段進(jìn)行研究，如溶解度曲線所示，大豆分離蛋白的溶解度在pH4～5時(shí)，溶解度在19%以下，呈現(xiàn)出較差的溶解性，并伴有沉淀及聚集體的形成，因而在后期的光譜分析中，未選取這一區(qū)段的pH值，主要由于光譜分析要求樣品具有良好的溶解性，否則圖譜將無(wú)法表現(xiàn)出典型的結(jié)構(gòu)特征。

2.2 不同pH值的大豆分離蛋白表面疏水性曲線

圖2 不同pH值對(duì)大豆分離蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of pH on surface hydrophobicity of soybean protein isolate

由圖2可知，大豆分離蛋白的表面疏水性在等電點(diǎn)兩側(cè)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，并在等電點(diǎn)附近出現(xiàn)最大值。與溶解度曲線的比較發(fā)現(xiàn)，在等電點(diǎn)以外的其他pH值下大豆分離蛋白的表面疏水值與溶解度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這與Hayakawa等[7]的研究相符。分析其原因在于蛋白質(zhì)的溶解性取決于蛋白質(zhì)分子的親水性/疏水性的平衡，這種平衡取決于蛋白質(zhì)分子的氨基酸組成，尤其取決于暴露于蛋白質(zhì)分子表面的氨基酸組成[8]。在氨基酸側(cè)鏈殘基中，亮氨酸、異亮氨酸等疏水性殘基，通過(guò)疏水鍵相互結(jié)合于蛋白質(zhì)分子中心，形成疏水性區(qū)域；另一方面，谷氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、賴氨酸等親水性殘基，配列于能夠與水分子接觸的蛋白質(zhì)分子外側(cè)，形成親水性區(qū)域[9]。非極性基團(tuán)轉(zhuǎn)向分子內(nèi)部，形成疏水鍵；極性基團(tuán)轉(zhuǎn)向分子內(nèi)部的，可以相互作用形成氫鍵和鹽鍵，轉(zhuǎn)向分子表面的，可與水分子相互作用。蛋白質(zhì)的非極性疏水基團(tuán)常趨向于分子結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部，形成一個(gè)疏水核，這種聚集是由于水對(duì)非極性基團(tuán)的排斥造成的，疏水側(cè)鏈基團(tuán)從水介質(zhì)轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水環(huán)境是受熵增的驅(qū)動(dòng)自發(fā)進(jìn)行的[10]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，并非上述一種結(jié)構(gòu)模式，疏水核如果不在核心而暴露在分子表面，則表現(xiàn)為一定的疏水性，而親水溶解性降低，由于疏水、親水程度不同，造成蛋白質(zhì)不同的溶解分散性[11]。同時(shí)研究表明，具有較高的溶解性蛋白質(zhì)其分子表面存在較少數(shù)量的疏水性殘基[5]。

2.3 pH值對(duì)大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圓二色光譜可以表征不同pH值對(duì)大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，圖3A表示不同pH值的大豆分離蛋白圓二色光譜圖，圖3B為不同pH值大豆分離蛋白在208nm及222nm波長(zhǎng)處的平均殘基摩爾橢圓度(θ)，用于直觀的分析α-螺旋的變化趨勢(shì)。

圖3 pH值對(duì)大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of pH on secondary structure of soybean protein isolate

由圖3A可知，大豆分離蛋白在194nm附近顯示一個(gè)正峰，218nm波長(zhǎng)處顯示一個(gè)負(fù)肩峰，208nm和222nm顯示出兩個(gè)負(fù)凹槽，并且還在220～230nm之間存在一個(gè)很微弱的正峰。194nm正峰和218nm負(fù)肩峰的存在表示大豆蛋白中存在β-折疊結(jié)構(gòu)，208nm和222nm負(fù)凹槽則是由于α-螺旋結(jié)構(gòu)引起的負(fù)科頓效應(yīng)引起的，220～230nm之間的微弱正峰則可表征蛋白質(zhì)中存在無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。由此可見(jiàn)大豆分離蛋白包含4種類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)組分：α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角，β-折疊以及無(wú)規(guī)卷曲，其中β-折疊以及無(wú)規(guī)卷曲含量較多[12]，這與通過(guò)CONTIN/LL程序分析出的結(jié)果相吻合，見(jiàn)表1。通過(guò)擬合分析發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白隨著pH值的升高，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量逐漸增大，β-折疊結(jié)構(gòu)逐漸降低，而無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)略微降低，表明大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生由β-折疊結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。圖3B可以看出，由于α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量會(huì)隨208和222nm處峰強(qiáng)的負(fù)增長(zhǎng)而增大，因此通過(guò)[θ]208nm及[θ]222nm數(shù)值的降低趨勢(shì)可以看出，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量隨pH值升高而增大，與CONTIN/LL程序分析結(jié)論一致。

表1 CONTIN/LL程序分析出不同pH值的大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structure contents of soybean protein isolate at different pH conditions %

與中性及堿性條件比較發(fā)現(xiàn)pH6(弱酸性)時(shí)大豆分離蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)較低，分析其原因可能為：α-螺旋結(jié)構(gòu)主要由多肽鏈上羰基(-CO)和氨基(NH-)之間的氫鍵穩(wěn)定[13-14]，而大豆分離蛋白的等電點(diǎn)約為4.5，這說(shuō)明在中性條件下，蛋白是呈負(fù)電荷的，酸性環(huán)境可能會(huì)增加蛋白間因?yàn)殡姾芍泻投a(chǎn)生的靜電作用，從而影響氫鍵的穩(wěn)定性[14]。靜電作用和氫鍵穩(wěn)定性的變化會(huì)依次引起在酸性條件下α-螺旋的丟失[15]。

Kato等[16]通過(guò)對(duì)卵白蛋白和溶菌酶的CD譜圖波長(zhǎng)為220nm處橢圓率的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的表面疏水性和α-螺旋結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，即蛋白質(zhì)分子內(nèi)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低時(shí)，分子內(nèi)部“埋藏”的疏水性位點(diǎn)的暴露程度增大，表現(xiàn)出更強(qiáng)的表面疏水性。因此，大豆分離蛋白在pH6～9的范圍內(nèi)，隨著pH值的降低，[θ]222nm的數(shù)值逐漸升高，表明分子內(nèi)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量逐漸降低(圖3B)，分子內(nèi)部“埋藏”的疏水性位點(diǎn)的暴露程度增大，表現(xiàn)出更大的表面疏水性，這與大豆分離蛋白的表面疏水性曲線所表現(xiàn)出的增大趨勢(shì)相符。

2.4 pH值對(duì)大豆分離蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

在295nm激發(fā)的大豆分離蛋白樣品熒光發(fā)射光譜主要是由色氨酸所發(fā)射的，和其他含色氨酸和酪氨酸殘基的球蛋白一樣，由于其分子中從酪氨酸殘基到色氨酸殘基之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致了酪氨酸殘基的熒光熄滅和色氨酸殘基的熒光增加。因此大豆分離蛋白的熒光峰實(shí)際上是色氨酸殘基的熒光峰，其峰位在325～350nm波長(zhǎng)之間[17]。

蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在不同的環(huán)境中具有不同的狀態(tài)，這是由于蛋白中所含的羧基和氨基個(gè)數(shù)和所處的環(huán)境決定的。蛋白質(zhì)中可離解的基團(tuán)除了一端的α-氨基和另一端α-羧基外，大多數(shù)是側(cè)鏈的基團(tuán)，如天冬氨酸的β-羧基、組氨酸的咪唑基、賴氨酸的ε-氨基、酪氨酸的羥基等。蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)的電離情況隨著溶液中pH值的變化而改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的構(gòu)象的變化。因而，通過(guò)研究溶液中酸堿度的變化對(duì)大豆分離蛋白熒光性質(zhì)的影響，可以得出其結(jié)構(gòu)信息。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，在溶液酸堿度從pH 6.0到pH 9.0環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)不同pH值對(duì)大豆分離蛋白的熒光光譜形狀幾乎沒(méi)有影響(圖4)，而對(duì)其λmax及熒光強(qiáng)度有改變，其變化情況見(jiàn)表2。

圖4 不同pH值大豆分離蛋白的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of soybean protein isolate at different pH conditions

表2 不同pH值的大豆分離蛋白的熒光強(qiáng)度及λmaxTable 2 Fluoreseenee intensity and λmax of soybean protein isolate at different pH conditions

大豆分離蛋白的λmax分布在331.2～338.4nm范圍內(nèi)，有研究表明λmax與Trp殘基所處微環(huán)境的有關(guān)，λmax小于330nm表示Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性環(huán)境中，λmax大于330nm時(shí)表明Trp殘基位于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中[18]。由此可見(jiàn)，大豆分離蛋白在pH6～9的范圍內(nèi)，其Trp殘基主要分布于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中。由表2可知，隨著pH值增大，大豆分離蛋白的λmax向長(zhǎng)波方向移動(dòng)(紅移)，表明原來(lái)處于球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部非極性環(huán)境中的Trp殘基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子外部，其所處的微環(huán)境極性有所提高。

另一方面，大豆分離蛋白在pH6～9的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨pH值增大而增強(qiáng)。分析其熒光強(qiáng)度的變化可能與大豆分離蛋白中Trp殘基的量子產(chǎn)率及Tyr→Trp殘基能量傳遞有關(guān)[19]。由于實(shí)驗(yàn)研究選擇的pH值范圍在微酸性及堿性范圍內(nèi)，因而pH值的變化對(duì)大豆分離蛋白電荷分布影響較小，表現(xiàn)在對(duì)Trp殘基的發(fā)光效率影響不大。而Tyr→Trp能量傳遞可能受pH值變化的影響，從而導(dǎo)致Trp殘基總的熒光強(qiáng)度隨pH值的變化而改變。另外，隨著pH值的增大，受質(zhì)子解離作用影響，原本帶負(fù)電荷且靠近Trp殘基的帶電基團(tuán)離開(kāi)，解除了對(duì)Trp熒光的猝滅作用。

蛋白質(zhì)中的3種芳香氨基酸殘基與其他氨基酸相比疏水性較強(qiáng)，其中Trp和Phe殘基是高度疏水的非極性基團(tuán)，Tyr殘基是中度疏水的極性基團(tuán)。目前關(guān)于利用上述疏水性氨基酸微環(huán)境變化預(yù)測(cè)表面疏水性關(guān)系的研究較多，但主要用于蛋白變性過(guò)程中，利用在酸堿變性時(shí)，蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，結(jié)構(gòu)的變化對(duì)疏水性氨基酸殘基在蛋白質(zhì)分子內(nèi)外的分配產(chǎn)生影響，從而改變了蛋白質(zhì)分子的表面疏水性，使蛋白質(zhì)分子表面功能發(fā)生變化。

在本研究中主要的研究對(duì)象為Trp殘基，其在pH值的增大過(guò)程中的“暴露”在一定意義上表明大豆分離蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但這種“暴露”并未帶來(lái)類似于蛋白質(zhì)變性過(guò)程中疏水性氨基酸“暴露”而引起的表面疏水性降低，關(guān)于上述現(xiàn)象的原因仍需進(jìn)一步研究。結(jié)合2.3節(jié)關(guān)于二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析考慮，原因可能在于在非變性狀態(tài)下大豆分離蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生類似變性過(guò)程中發(fā)生的解折疊現(xiàn)象，“包裹”在球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)并未完全“暴露”出來(lái)[20]，而是在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上伴隨著多肽鏈逐步卷曲為其它特定構(gòu)象而使疏水性氨基酸殘基發(fā)生“暴露”，這種“暴露”對(duì)表面疏水性的影響不具有代表意義。綜上所述，疏水性較強(qiáng)的芳香氨基酸殘基微環(huán)境變化目前仍無(wú)法用于預(yù)測(cè)非變性蛋白質(zhì)表面疏水性的變化。

3 結(jié) 論

3.1 大豆分離蛋白的表面疏水性隨pH值的變化趨勢(shì)為：在等電點(diǎn)兩側(cè)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，并在等電點(diǎn)附近出現(xiàn)最大值。

3.2 結(jié)合溶解性研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白表面疏水性與溶解度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

3.3 圓二色光譜分析表明，隨著pH值的升高，大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生由β-折疊結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。這種變化進(jìn)一步驗(yàn)證了蛋白質(zhì)的表面疏水性和α-螺旋結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

3.4 熒光光譜分析表明，隨著pH值的增大，大豆分離蛋白的熒光強(qiáng)度及λmax均呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，表明大豆分離蛋白中Trp殘基所處微環(huán)境極性增強(qiáng)，這種變化對(duì)表面疏水性的影響尚需進(jìn)一步研究。

[1]SHEARD P R, FELLOWS A, LEDWARD D A, et al. Macromolecular charges associated with the heat treatment of soya isolate[J]. Food Technology, 1988, 21(12): 55-60.

[2]HUANG Weining, SUN Xiuzhi. Adhesive properties of soy protein modified by sodium dodecyl sulfate and sodium dodecylbenzenz sulfonate [J]. JAOCS, 2000, 77(7): 705-708.

[3]FUKUSHIMA D. Recent progress of soybean protein isolate foods: chemistry, technology and nutrition[J]. Food Reviews International, 1991, 7(3): 323-351.

[4]LOWRY O H, ROSEMBROUG H J, LEWIS A, et al. Protein measurement with the folin phenol reagent[J]. Journal of Biological Chemistry, 1951, 193(1): 265-275.

[5]KATO A, NAKAI S. Hydrophobicity determined by a fluorescence probe method and its correlation with surface properties of proteins[J]. Biochem Biophy Acta, 1980, 624(1): 13-20.

[6]HUANG Weining, SUN Xiuzhi. Adhensive properties of soy proteins modified by urea and guanidine hydrechloride[J]. JAOCS, 2000, 77(1): 101-104.

[7]SHIGERU H, SHURYO N. Relationships of hydrophobicity and net charge to the solubility of milk and soy proteins[J]. Journal of Food Science, 1985, 50(2): 486-491.

[8]ANDRES M, SINEIRO J, HERMINIA D, et al. Functionality of oilseed protein products: a review[J]. Food Research International, 2006, 39(9): 945-963.

[9]SHURYO N. Structure-function relationships of food proteins with an emphasis on the importance of protein hydrophobicity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1983, 31(4): 676-683.

[10]PETRUECELLI S, ANON M C. Relationship between the method of obtention and the structural and functional properties of soy protein isolates.2.Surface properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1994, 42(10): 2170-2176.

[11]CHERRY J P. Protein functionality in foods[M]. Washington, D C: ACS Symposium, 1980: 147.

[12]SREERAMA N, VENYAMINOV S Y U, WOODY R W. Estimation of the number of α-helical andβ-strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy[J]. Protein Science, 1999, 8(2): 370-380.

[13]SANO T, OHNO T, OTSUKA-FUCHINO H, et al. Carp natural actomyosin: thermal denaturation mechanism[J]. Journal of Food Science, 1994, 59(5): 1002-1008.

[14]DAMODARAN S. Amino acids, peptides, and proteins[M]. 3rd ed. New York: Marcel Dekker, 1996: 321-429.

[15]LIU Ru, ZHAO Siming, XIONG Shanbai, et al. Role of secondary structure in the gelation of porcine myosin at different pH values[J]. Meat Science, 2008, 80(3): 632-639.

[16]KATO A, TSUTSUI N, MATSUDOMI N, et al. Effects of partial denaturation on surface properties of ovalbumin and lysozyme[J]. Agricultural and Biological Chemistry. 1981, 45(12): 2788-2760.

[17]KALAPATHY U, HETTIARACHCHY N S, RHEE K C. Effect of drying methods on molecular properties and functionalities of disulfide bond-cleaved soy proteins[J]. Journal of the American Oil Chemists’Society, 1997, 74(3): 195-199.

[18]VIVIAN J T, CALLIS P R. Mechanisms of tryptophan fluorescence shifts in proteins[J]. Biophysical Journal, 2001, 80(5): 2093-2109.

[19]劉清亮, 吳雙頂, 張玉慧, 等. 皖南尖吻蛇毒糖增水解酶的熒光光譜研究[J]. 無(wú)機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 14(1): 53-57.

[20]ANNA M, ZOFIA D. Differential scanning microcalorimetry study of the thermal denaturation of haemoglobin[J]. Biophysical Chemistry, 2005, 118(2): 93-101.

Effect of pH on Conformation and Surface Hydrophobicity of Soybean Protein Isolate

WANG Zhong-jiang1，JIANG Lian-zhou1,2,*，WEI Dong-xu1,3，LI Yang1，WANG Chen1，LI Dan1,4
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. National Soybean Engineering Technology Research Center, Harbin 150030, China；3. Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China；4. Ningde Normal University, Ningde 352100, China)

Lowry method, ANS fluorescence probe, circular dichroism and fluorescent spectroscopy were applied to explore the solubility, surface hydrophobicity, secondary structure and tertiary structure of soybean protein isolate at different pH conditions. The results showed that the transformation from β-sheet structure to α-helix structure, and the microenvironment polarity of Trp residues revealed an obvious increase with increasing pH. A negatively linear correlation between the surface hydrophobicity and solubility of soybean protein isolate was observed. Meanwhile, the surface hydrophobicity of soybean protein isolate was negatively correlated with the amount of α-helix structure.

soybean protein isolate；pH；hydrophobicity；structure

TS201.2

A

1002-6630(2012)11-0047-05

2011-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C200101)

王中江(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：zibeizhe@126.com

*通信作者：江連洲(1960—)， 男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：jlzname@163.com