楊曉韜， 李 春,2， 周曉宏*

(1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081)

7種食品防腐劑對肉制品污染微生物的抑菌效果比較研究

楊曉韜1， 李 春1,2， 周曉宏2,*

(1.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081)

通過測定抑菌率和最低抑菌質(zhì)量濃度，研究化學(xué)防腐劑山梨酸鉀、雙乙酸鈉、單辛酸甘油酯、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)以及生物防腐劑乳酸鏈球菌素(Nisin)、殼聚糖、ε-聚賴氨酸(ε-PL)對12株肉制品腐敗(包括2株環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、3株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、3株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、2株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、1株蜂房哈夫尼亞菌(Hafnia alvei)以及1株腸球菌(Enterococcus))的抑菌活性。結(jié)果表明：7種防腐劑對供試菌都有一定的抑菌效果，抑菌效果強(qiáng)弱順序?yàn)椋篘isin＞殼聚糖＞ε-PL＞單辛酸甘油酯＞EDTA＞雙乙酸鈉＞山梨酸鉀。3種生物防腐劑的抑菌效果明顯強(qiáng)于其他4種化學(xué)防腐劑。通過比較各種防腐劑對不同種和同種不同株的細(xì)菌的抑菌效果，表明同一種防腐劑不僅對不同種的細(xì)菌抑菌效果不同，即使對同種不同株的細(xì)菌其抑菌效果也有很大差異。

食品防腐劑；肉制品腐?。灰志Ч?/p>

肉類制品具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的感官性質(zhì)，能給人體提供必需的蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物、無機(jī)鹽及維生素等多種營養(yǎng)素，是人類膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分[1]。隨著人類食物品種的增多、銷量的增長，危害肉類制品食品安全的因素也隨之增多，使肉類制品食品安全問題日趨復(fù)雜，在眾多導(dǎo)致肉類制品安全問題的因素中，微生物污染是最主要的因素[2]。因此防止肉類制品由微生物引起的腐敗，增加其安全性，減少肉類制品因污染引起的浪費(fèi)是肉制品加工企業(yè)必須解決的關(guān)鍵問題[3]。為了有效抑制肉制品中微生物的生長，延長肉制品的保質(zhì)期，加強(qiáng)其安全性，在肉制品加工過程中，人們采用了許多不同的手段來殺死或者抑制微生物，其中添加防腐劑是最方便且有效的一種方法，因而被廣泛使用于肉制品加工行業(yè)中[4]。

食品防腐劑，即用于防止食品因微生物引起的變質(zhì)，提高食品保存性能，延長食品保質(zhì)期而使用的食品添加劑[5]。我國現(xiàn)行的GB2760—2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》允許使用的防腐劑共有27種，其抑菌效果已有不少報(bào)道，但因各學(xué)者實(shí)驗(yàn)用菌種及其來源不同，即使用同一種菌，若菌株不同或已發(fā)生變異其結(jié)果也會不同[6]，且實(shí)驗(yàn)條件也不一致，因此難以從現(xiàn)有文獻(xiàn)中全面衡量各種食品防腐劑對肉制品腐敗菌的抑制作用。為此，本實(shí)驗(yàn)從不同來源的腐敗肉制品中分離篩選出6種共12株細(xì)菌，研究7種常用的食品防腐劑對不同菌種以及同種不同株的細(xì)菌之間的抗菌活性差異，旨在為肉制品和其他食品的防腐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山梨酸鉀、雙乙酸鈉、EDTA(均為食品級) 北京北方霞光食品添加劑有限公司；單辛酸甘油酯 杭州康源食品科技有限公司；Nisin、ε-聚賴氨酸(ε-PL) 浙江銀象生物工程有限公司；殼聚糖(脫乙酰度97.6%) 山東省萊州市海力生物制品有限公司；其余試劑均為分析純。

2株環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、3株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、3株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、2株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、蜂房哈夫尼亞菌(Hafnia alvei)、腸球菌(Enterococcus)分離自不同來源的腐敗肉制品。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

肉制品模擬培養(yǎng)基(meat simulating medium，MSM)、肉制品模擬瓊脂培養(yǎng)基(meat simulating and agar medium，MSMA)，是在劉堅(jiān)真等[7-9]優(yōu)化的測定食品細(xì)菌總數(shù)培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，結(jié)合肉制品成分進(jìn)一步優(yōu)化的食品微生物通用培養(yǎng)基。MSM配方：酵母膏2.5g、牛肉膏1.0g、葡萄糖1.0g、胰蛋白胨5.0g、NaCl 8.5g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.2，115℃滅菌20min。其中用酵母膏和牛肉膏模擬肉制品中的蛋白成分，用葡萄糖模擬肉制品中的淀粉等多糖成分。在MSM基礎(chǔ)上添加15g/1000mL瓊脂粉即為MSMA。

1.2.2 菌懸液的制備

將6種12株細(xì)菌(除蜂房哈夫尼亞菌為革蘭氏陰性菌之外，其余5種均為革蘭氏陽性菌)分別在MSMA斜面培養(yǎng)基上32℃條件下培養(yǎng)24h活化，活化后的菌種用接種環(huán)在斜面接一環(huán)于MSM中，在32℃條件下培養(yǎng)24h，采用平板計(jì)數(shù)法測定菌體濃度，將培養(yǎng)液稀釋為含菌體107CFU/mL的菌懸液，4℃冰箱暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抑菌活性的測定

首先將7種防腐劑配制成質(zhì)量濃度分別為100、10、 1mg/mL的溶液，殼聚糖溶液中添加一定量的乳酸以使其溶解。Nisin溶液用無菌水在無菌操作臺中配制，其余防腐劑溶液配好后經(jīng)121℃滅菌20min， 4℃冰箱暫存?zhèn)溆?。在含?.9mL MSM的試管中，實(shí)驗(yàn)組加入1mL防腐劑溶液，0.1mL菌懸液；陽性對照組用無菌水取代防腐劑，陰性對照組用MSM取代菌液(用于比濁法調(diào)零，平板稀釋法無陰性對照)。所有試管中的培養(yǎng)液總體積均為10mL，使各防腐劑的終質(zhì)量濃度分別為10、1、0.1mg/mL。將體系充分混勻后于32℃條件下培養(yǎng)48h。取出試管，充分振蕩，并對各試管進(jìn)行逐個(gè)檢查，用肉眼觀察其混濁程度。

平板稀釋法：用于單辛酸甘油酯、ε-PL、殼聚糖、Nisin抑菌活性的測定。將上述培養(yǎng)液經(jīng)不同質(zhì)量濃度稀釋，各取0.1mL涂平板，32℃條件下培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)，與陽性對照比較，并以此表征防腐劑的抗菌活性。

比濁法：用于山梨酸鉀、雙乙酸鈉、EDTA抑菌活性的測定。以陰性對照為空白參比，用紫外分光光度計(jì)于620nm波長處測定培養(yǎng)液的濁度(OD值)，與陽性對照比較，并以此表征防腐劑的抗菌活性。

平板稀釋法抑菌率的計(jì)算[10]：

1.2.4 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定

MIC的測定：首先根據(jù)防腐劑3種質(zhì)量濃度(10、1、0.1mg/mL)的抑菌率初步確定其MIC的范圍，在此范圍內(nèi)設(shè)定密集的質(zhì)量濃度梯度并測定其抑菌率，選擇抑菌率為100%的防腐劑質(zhì)量濃度，即為防腐劑的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度的防腐劑對各種細(xì)菌的抑菌率

由圖1～3可知，7種防腐劑對各種細(xì)菌都有一定的抑菌作用，且抑菌效果隨著防腐劑質(zhì)量濃度的增大而加強(qiáng)。總體來看，Nisin、殼聚糖和ε-PL的抑菌效果明顯優(yōu)于其他防腐劑，EDTA和單辛酸甘油酯次之，而山梨酸鉀對6種供試菌的抑菌效果最不明顯，低質(zhì)量濃度時(shí)甚至有助于部分細(xì)菌(如腸球菌)的生長，雙乙酸鈉效果也不太好。值得關(guān)注的是Nisin對5種革蘭氏陽性菌的抑菌效果十分明顯，質(zhì)量濃度為0.1mg/mL時(shí)，其抑菌率幾乎都可以達(dá)到100%，但是對于革蘭氏陰性的蜂房哈夫尼亞菌抑菌效果卻只有2%，質(zhì)量濃度為1mg/mL和10mg/mL時(shí)，其抑菌率也只能達(dá)到35%和75%；ε-PL也有和Nisin類似的趨勢，只是程度不同而已；而殼聚糖對革蘭氏陰性菌的抑菌效果最好，質(zhì)量濃度為0.1mg/mL時(shí)，雖然其抑菌率只有39%，但在7種防腐劑中為最高，當(dāng)質(zhì)量濃度升高到1mg/mL時(shí)，其抑菌率已達(dá)到100%。

圖1 質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的防腐劑對各種菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against different species of bacteria

圖2 質(zhì)量濃度為1mg/mL的防腐劑對各種菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 1 mg/mL against different species of bacteria

圖3 質(zhì)量濃度為10mg/mL的防腐劑對各種菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 10 mg/mL against different species of bacteria

2.27 種食品防腐劑對同種不同株細(xì)菌的抑菌效果比較

2.2.17 種防腐劑對2株環(huán)狀芽孢桿菌的抑菌效果

圖4 質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的防腐劑對環(huán)狀芽孢桿菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against two different strains of Bacillus circulans

由圖4可知，質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的7種防腐劑對環(huán)狀芽孢桿菌的抑菌率大小為：Nisin、殼聚糖＞ε-PL＞單辛酸甘油酯＞ED TA＞雙乙酸鈉＞山梨酸鉀。其中Nisin、殼聚糖對兩株菌的抑菌率都為100%；單辛酸甘油酯、ε-PL和EDTA 3種防腐劑對環(huán)狀芽孢桿菌-1和環(huán)狀芽孢桿菌-2的抑菌效果有差異但不明顯，抑菌率相差不超過5%；雙乙酸鈉對2株菌的抑菌效果相差較大，對環(huán)狀芽孢桿菌-1的抑菌率不足15%，而對環(huán)狀芽孢桿菌-2的抑菌率接近50%；而該質(zhì)量濃度的山梨酸鉀對2株菌都沒有抑菌效果。

2.2.27 種防腐劑對2株凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌效果

圖5 質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的防腐劑對凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against two different strains of Bacillus coagulans

由圖5可知，質(zhì)量濃度為0.1mg/mL時(shí)，Nisin、殼聚糖、ε-PL對2株來源不同的凝結(jié)芽孢桿菌的抑菌率都達(dá)到100%；EDTA對兩株菌的抑菌率分別接近90%和80%；雙乙酸鈉對凝結(jié)芽孢桿菌-1的抑菌率為0，對凝結(jié)芽孢桿菌-2只有微弱的抑菌效果；單辛酸甘油酯對凝結(jié)芽孢桿菌-1的抑菌率為0，但對凝結(jié)芽孢桿菌-2的抑菌率達(dá)到90%以上，差異巨大；而該質(zhì)量濃度的山梨酸鉀對2株菌同樣沒有抑菌效果。

2.2.37 種防腐劑分別對3株地衣芽孢桿菌的抑菌效果

圖6 質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的防腐劑對地衣芽孢桿菌的抑菌效果Fig.6 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against three different strains of Bacillus licheniformis

由圖6可知，雖然3株地衣芽孢桿菌來源相同，但是結(jié)果表明，同種防腐劑對3株菌的抑菌效果依然有不同程度的差異。Nisin和ε-PL的抑菌率最高，在99%以上，且對3株菌的抑菌效果基本一致；殼聚糖和EDTA都有明顯的抑菌效果，但是3株菌之間也一定的差異；而山梨酸鉀、雙乙酸鈉、單辛酸甘油酯對3株菌的抑菌效果有很大差異，山梨酸鉀對地衣芽孢桿菌-1的抑菌率超過80%，而對地衣芽孢桿菌-2和地衣芽孢桿菌-3卻沒有抑菌作用；相反，單辛酸甘油酯對地衣芽孢桿菌-1的抑菌率為0，但對地衣芽孢桿菌-2和地衣芽孢桿菌-3的抑菌率卻都在97%以上。由此可見，即使是來源相同的同種不同株的細(xì)菌，同一種防腐劑對它們的抑菌效果往往也會出現(xiàn)明顯的差別。

2.2.47 種防腐劑分別對3株枯草芽孢桿菌的抑菌效果

圖7 質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的防腐劑對枯草芽孢桿菌的抑菌效果Fig.7 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against three different strains of Bacillus subtilis

由圖7可知，Nisin對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，抑菌率都在98%以上；殼聚糖次于Nisin，但抑菌率也都超過92%；ε-PL雖不及Nisin和殼聚糖，但抑菌率也都在80%以上。而其余4種防腐劑的抑菌效果在3株菌之間都有較大的差異，雖然前2株菌來源相同，但山梨酸鉀、雙乙酸鈉以及EDTA對二者的抑菌效果差異明顯。

2.37 種食品防腐劑的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)分析

表1 7種食品防腐劑對細(xì)菌的MIC值Table 1 MICs of seven food preservatives against different species of bacteria mg/mL

表1為7種食品防腐劑對12株肉制品腐敗菌的最低抑菌質(zhì)量濃度測定結(jié)果，MIC值越低，相應(yīng)食品防腐劑的抑菌作用越強(qiáng)。可以看出，Nisin對革蘭氏陽性菌都有很強(qiáng)的抑菌作用，在7種防腐劑中，它的最低抑菌質(zhì)量濃度都是最小的，但是對于革蘭氏陰性的蜂房哈夫尼亞菌，它的抑菌效果卻不明顯；殼聚糖對革蘭氏陽性菌的最小抑菌質(zhì)量濃度雖然比Nisin略大，但優(yōu)于其他防腐劑，尤其是Nisin抑菌效果不好的蜂房哈夫尼亞菌，殼聚糖對它的最低抑菌質(zhì)量濃度是最小的。而山梨酸鉀對各株菌的最小抑菌質(zhì)量濃度明顯高于其他防腐劑，其抑菌效果在7種防腐劑中是最差的，分析其原因可能有以下三方面：首先山梨酸鉀對霉菌、酵母和好氣性菌均有抑制作用，但對嫌氣性芽孢形成菌與嗜酸乳桿菌則幾乎無效[12]，即山梨酸鉀并不是廣譜的防腐劑；同時(shí)山梨酸鉀屬于酸性防腐劑，其防腐效果隨pH值升高而降低，適用于pH5.5以下的食品防腐；此外山梨酸鉀的抑菌作用比抗菌作用強(qiáng)，有研究表明將其加入已經(jīng)污染了大量微生物的食品中，則基本無效[13]。

各防腐劑最低抑菌質(zhì)量濃度綜合排序：Nisin＜?xì)ぞ厶牵鸡?PL＜單辛酸甘油酯＜EDTA＜雙乙酸鈉＜山梨酸鉀。

2.4 Nisin、殼聚糖、ε-PL抑菌作用的構(gòu)效分析

與其他4種化學(xué)防腐劑相比，3種生物防腐劑Nisin、殼聚糖、ε-PL使用劑量低且防腐效果好，同時(shí)具有安全、天然、健康的特點(diǎn)，因而倍受人們的關(guān)注[12]。

Nisin是一種兩親型，由34個(gè)氨基酸組成的帶正電荷的小肽，可以作用在細(xì)胞壁帶負(fù)電荷的陰離子成分上，如細(xì)胞壁的磷壁酸、糖醛酸、脂磷壁酸、酸性多糖或細(xì)胞膜的磷脂上，并形成孔狀結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞膜的滲漏，導(dǎo)致小分子質(zhì)量的細(xì)胞成分如鉀離子、氫離子、氨基酸、核苷酸(如ATP、ADP)等物質(zhì)迅速流出，從而引起細(xì)胞死亡[13]。從Nisin的抑菌譜來看，Nisin對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑菌效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性細(xì)菌。這是由于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖含量少，但組成復(fù)雜。主要包括磷脂、蛋白質(zhì)和脂多糖(LPS)等，十分致密，僅允許分子質(zhì)量小于600D的分子通過。Nisin的分子質(zhì)量為3500D左右，無法正常通過革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁，因此也就無法達(dá)到細(xì)胞膜[14]。

殼聚糖是一種天然多聚陽離子生物多糖[15]，分子結(jié)構(gòu)中含有羥基和氨基，因此，各分子之間能夠形成氫鍵，并且氨基葡萄糖單體的C2位上的氨基在pH6以下時(shí)質(zhì)子化后帶有正電荷，因而可以與細(xì)胞表面上帶有負(fù)電荷的分子基團(tuán)相互作用而改變細(xì)胞的通透[16]，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)組分如蛋白質(zhì)與葡萄糖等的泄漏[16-18]，也有可能在細(xì)胞表面形成一層高分子膜，阻止了營養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，從而起到抑菌殺菌作用[19-20]。

ε-PL呈高聚合多價(jià)陽離子態(tài)，其抑菌機(jī)理可能是由于它可以作用于生物膜系統(tǒng)和蛋白合成系統(tǒng)，與核糖體結(jié)合從而抑制蛋白和酶生物大分子的合成，結(jié)合在生物膜上的ε-PL破壞膜結(jié)構(gòu)完整性，使細(xì)胞的選擇性改變，引起細(xì)胞的物質(zhì)、能量和信息傳遞中斷，呼吸作用受到影響，細(xì)菌能量代謝和物質(zhì)代謝破壞，能量物質(zhì)ATP和還原物質(zhì)NADH虧缺，合成代謝受阻，導(dǎo)致胞內(nèi)溶酶體膜破裂而誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生自溶作用，最終使細(xì)胞死亡[21]。

由于細(xì)菌表面均帶負(fù)電荷，所以這3種防腐劑對大部分細(xì)菌具有較好的抑菌效果，是更加安全可靠的新一代食品防腐劑[22]。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)對山梨酸鉀、Nisin、殼聚糖等7種食品防腐劑進(jìn)行了抑菌效果的比較研究。結(jié)果表明7種防腐劑對各種供試菌都有不同程度的抑菌效果，防腐劑質(zhì)量濃度越高其抑菌效果越好?？傮w來看，7種供試防腐劑抑菌效果強(qiáng)弱順序?yàn)椋篘isin＞殼聚糖＞ε-PL＞單辛酸甘油酯＞EDTA＞雙乙酸鈉＞山梨酸鉀。同一種防腐劑，特別是抑菌效果中等的防腐劑，不僅對不同種的細(xì)菌抑菌效果不同，而且對于同種不同株的細(xì)菌，其抑菌效果也不盡相同，甚至相差很大。因此，對于防腐劑的抑菌效果，不能單純以菌種來定論，應(yīng)具體到所涉及的每一株菌。對于大多數(shù)供試菌而言，Nisin、殼聚糖、ε-PL的抑菌效果最好，其最低抑菌質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于山梨酸鉀。隨著人們生活和消費(fèi)水平的提高，人們對肉制品安全提出了更高的要求，肉制品加工企業(yè)為了順應(yīng)市場的變化，其產(chǎn)品也越來越向“綠色”和“天然”等方向轉(zhuǎn)變[23]，本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明了生物防腐劑比化學(xué)防腐劑更為高效、廣譜，因此，天然、安全的生物防腐劑將是未來防腐領(lǐng)域的重點(diǎn)。

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Comparison of Antibacterial Effects of Seven Food Preservatives on Spoilage Microorganisms in Meat

YANG Xiao-tao1，LI Chun1,2，ZHOU Xiao-hong2,*
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shihezi University, Shihezi 832003, China；2. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China)

The antibacterial activities of food preservatives including potassium sorbate, sodium diacetate, capryl monoglyceride, disodium ethylene-diamine-tetraacetate (EDTA), nisin, chitosan and ε-polylysine (ε-PL) against 12 meat spoilage strains such as 2 Bacillus circulans strains, 3 Bacillus subtilis strains, 3 Bacillus licheniformis strains, 2 Bacillus coagulans strains, 1 Hafnia alvei strain and an Enterococcus strain were investigated based on inhibitory rate and minimum inhibitory concentration. The results showed that seven food preservatives had inhibitory effect on all tested bacteria at different levels. They could be ranked in decreasing order of antibacterial activity as follows: nisin＞chitosan ＞ε-PL＞capryl monoglyceride＞EDTA ＞sodium diacetate＞potassium sorbate. Three bio-preservatives including nisin, chitosan and ε-PL had better antibacterial activity than other four chemical preservatives. In addition, the antibacterial activity of 7 preservatives exhibited great differences among species and among different strains from the same species.

food preservative；meat spoilage；antibacterial activity

TS202.3

A

1002-6630(2012)11-0012-05

2011-06-07

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD23B01；2011BAC11B06)

楊曉韜(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称诽砑觿┥锛夹g(shù)。E-mail：yangxiaotao521@126.com

*通信作者：周曉宏(1965—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zhouxh@bit.edu.cn