烏云達(dá)來(lái)，陸兆新*，呂鳳霞，別小妹，盧亞萍，孫會(huì)剛，查干其勞

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

嗜酸乳桿菌NX2-6產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化

烏云達(dá)來(lái)1,2，陸兆新1,*，呂鳳霞1，別小妹1，盧亞萍1，孫會(huì)剛1，查干其勞1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

在Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法(Box-Behnken設(shè)計(jì))對(duì)嗜酸乳桿菌NX2-6發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的關(guān)鍵影響因素，即葡萄糖質(zhì)量濃度、乙酸鈉質(zhì)量濃度、檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度及培養(yǎng)時(shí)間的最佳水平范圍進(jìn)行研究和探討。通過(guò)對(duì)發(fā)酵液抑菌圈直徑的二次多項(xiàng)回歸方程求解得知，在葡萄糖質(zhì)量濃度、乙酸鈉質(zhì)量濃度、檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間分別為60.0、8.0、5.0g/L和36h時(shí)，菌株NX2-6的發(fā)酵液抑菌圈直徑預(yù)測(cè)值為21.37mm，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)抑菌圈直徑實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)R2為0.9918。優(yōu)化后培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，發(fā)酵液抗菌活性增加約80.0%，由此可見(jiàn)，利用響應(yīng)曲面法對(duì)嗜酸乳桿菌NX2-6發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素條件進(jìn)行優(yōu)化是經(jīng)濟(jì)有效且科學(xué)合理的。

嗜酸乳桿菌；細(xì)菌素；發(fā)酵條件；優(yōu)化

細(xì)菌素是指由某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽或前體多肽，這些物質(zhì)可以殺滅或抑制與之相同或相似生境的其他微生物[1-2]。許多乳酸菌也能產(chǎn)生具有廣譜抑菌活性的細(xì)菌素，其中一部分乳酸菌細(xì)菌素可應(yīng)用于食品保藏。細(xì)菌素在食品工業(yè)中的應(yīng)用有助于減少化學(xué)防腐劑的添加量，并且降低滅菌強(qiáng)度，使食品更易于常溫保藏，從而保證產(chǎn)品品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)[3-5]。許多乳酸菌能產(chǎn)生具有廣譜抑菌活性的細(xì)菌素，目前已在革蘭氏陽(yáng)性菌中發(fā)現(xiàn)了50余種羊毛硫細(xì)菌素[6]。

傳統(tǒng)的單變量?jī)?yōu)化試驗(yàn)存在不考慮各因子之間交互作用的不足，雖然全因子試驗(yàn)可以解決這一問(wèn)題，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力[7]。響應(yīng)曲面分析法已成功地應(yīng)用于試驗(yàn)設(shè)計(jì)、建立模型、影響因素4的評(píng)價(jià)和最佳條件的確定等[8-9]，并已廣泛應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域，如培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化[10-13]、酶學(xué)性質(zhì)和提取技術(shù)的研究[14-16]、異黃酮[17-19]及藥物作用的研究[20-21]等方面。采用該法不僅可對(duì)影響因子最佳水平范圍及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，而且所需的試驗(yàn)組數(shù)相對(duì)較少，結(jié)果可靠性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)周期短。

筆者從內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)牧民家庭中以傳統(tǒng)發(fā)酵方法制作的酸馬奶中分離到一株產(chǎn)廣譜抗菌活性物質(zhì)的嗜酸乳桿菌NX2-6[22]。為了提高該菌株的細(xì)菌素產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其產(chǎn)細(xì)菌素具有顯著影響的4個(gè)因素[23]，即葡萄糖質(zhì)量濃度、乙酸鈉質(zhì)量濃度、檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度以及培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行研究。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)曲面法(Box-Behnken設(shè)計(jì))研究主要響應(yīng)因素的最佳水平及其交互作用，確定菌株NX2-6產(chǎn)細(xì)菌素的最佳發(fā)酵條件，以獲得較高產(chǎn)量的細(xì)菌素。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

供試菌株：從內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)酸馬奶樣品中分離的嗜酸乳桿菌NX2-6[22]；指示菌株：大腸桿菌AS1.487為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

脫脂乳培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基及牛肉膏蛋白胨液體或固體培養(yǎng)基根據(jù)文獻(xiàn)[24-25]方法配制并4℃保藏備用。

1.2 方法

1.2.1 供試菌液的制備

將嗜酸乳桿菌NX2-6接種于5mL脫脂乳培養(yǎng)基中，40℃、培養(yǎng)12～24h。傳代培養(yǎng)2次后接種于MRS液體培養(yǎng)基中，40℃培養(yǎng)12h，傳代培養(yǎng)2～3次后將末次培養(yǎng)物于4℃、3000r/min離心10min，棄掉上清液，加入與培養(yǎng)液等量的滅菌生理鹽水(約5mL)，振蕩混勻，再次于4℃、3000r/min離心10min，同法洗滌2次。然后，棄掉上清液的菌體中加入4.5mL滅菌生理鹽水，振蕩混勻，作為供試菌液。

1.2.2 指示菌的培養(yǎng)

將大腸桿菌AS1.487用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基活化，然后于牛肉膏蛋白胨斜面上劃線培養(yǎng)后4℃保藏備用，每2周繼代1次。使用前接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中，37℃、培養(yǎng)12～24h，使液體培養(yǎng)基中含菌量達(dá)到106CFU/mL，備用。

1.2.3 接種量與培養(yǎng)方法

將供試菌液按體積分?jǐn)?shù)2%接種到不同試驗(yàn)設(shè)計(jì)的組合培養(yǎng)基中，40℃條件下培養(yǎng)36～60h。

1.2.4 抗菌活性的測(cè)定

將發(fā)酵液經(jīng)4℃、3000r/min離心10min后用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，過(guò)濾上清液以大腸桿菌作為指示菌通過(guò)管碟法[26-27]測(cè)定其抗菌活性。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)菌株NX2-6產(chǎn)細(xì)菌素具有顯著影響的因素有葡萄糖質(zhì)量濃度、乙酸鈉質(zhì)量濃度、檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間[23]。本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)曲面法(Box-Behnken設(shè)計(jì))對(duì)菌株NX2-6產(chǎn)細(xì)菌素的顯著影響因素進(jìn)一步優(yōu)化。以發(fā)酵液抑菌圈直徑為響應(yīng)值，顯著影響因素的水平為自變量，每個(gè)自變量試驗(yàn)水平編碼分別為ˉ1、0、1(表1)。借助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design Expert，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平及編碼的設(shè)計(jì)Table 1 Independen variables and their coded and actual values in Box-Behnken design

設(shè)該模型通過(guò)最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)回歸方程為：

1.2.6 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最理想的5組發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并利用SAS(Release 8.01, USA)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行距離相關(guān)分析，驗(yàn)證嗜酸乳桿菌NX2-6產(chǎn)細(xì)菌素模型方程的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化嗜酸乳桿菌NX2-6產(chǎn)細(xì)菌素發(fā)酵條件

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)于影響嗜酸乳桿菌NX2-6產(chǎn)生細(xì)菌素不顯著的其他參數(shù)，如蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸出粉等，皆選擇Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的高水平，培養(yǎng)基初始pH值為6.0、培養(yǎng)溫度為40℃和接種量為2%。

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，利用Design-Expert 6.0.10軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得抑菌圈直徑預(yù)測(cè)值(Y^)對(duì)編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸方程見(jiàn)式(2)。

對(duì)方程(2)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明所選用的抑菌圈直徑二次多項(xiàng)模型具有極顯著性(P＜0.0001)，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9605，表明抑菌圈直徑的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and actual and predicted inhibition zone diameters

表3 抑菌圈直徑二次多項(xiàng)回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression coefficients in the fitted regression model for inhibition zone diameter and their significance

各項(xiàng)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)(表3)表明，葡萄糖質(zhì)量濃度、乙酸鈉質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌效果影響顯著，檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度對(duì)抑菌效果影響不顯著，而葡萄糖質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間、乙酸鈉質(zhì)量濃度和檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度、乙酸鈉質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間及檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用對(duì)抑菌效果影響顯著，但其他項(xiàng)不顯著。

2.2 抑菌圈直徑響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖1 葡萄糖質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間交互影響抑菌圈直徑的響應(yīng)面及其等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for inhibition zone diameter versus glucose concentration and fermentation time

圖1 顯示了在乙酸鈉質(zhì)量濃度12.0g/L和檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度4.0g/L時(shí)，葡萄糖質(zhì)量濃度與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的交互影響效應(yīng)。在培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度較低(30.0g/L)時(shí)，抑菌圈直徑隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，而培養(yǎng)時(shí)間較短(36h)時(shí)，抑菌圈直徑隨培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度提高而增大，即較低葡萄糖質(zhì)量濃度和較長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌圈的效應(yīng)與較高葡萄糖質(zhì)量濃度和較短培養(yǎng)時(shí)間時(shí)的效應(yīng)是相似的正效應(yīng)，但后者的效應(yīng)比前者更強(qiáng)，因此，提高培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度有利于提高細(xì)菌素的產(chǎn)量，并且縮短培養(yǎng)時(shí)間，從而縮短生產(chǎn)周期。據(jù)研究報(bào)道，葡萄糖對(duì)從酸馬奶酒中分離的兩株乳酸菌[28]和瑞士乳桿菌HF08[29]產(chǎn)抗菌物質(zhì)也具有促進(jìn)作用。

圖2 乙酸鈉質(zhì)量濃度和檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度交互影響抑菌圈直徑的響應(yīng)面及其等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for inhibition zone diameter versus sodium acetate and sodium citrate concentrations

圖2顯示了在葡萄糖質(zhì)量濃度45.0g/L和培養(yǎng)時(shí)間48h時(shí)，乙酸鈉質(zhì)量濃度和檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度對(duì)抑菌圈直徑的交互影響效應(yīng)。乙酸鈉質(zhì)量濃度較低(8.0g/L)時(shí)，檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度在1.0～4.8g/L范圍內(nèi)抑菌圈直徑隨檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度提高而增大。乙酸鈉質(zhì)量濃度較高(16.0g/L)時(shí)，檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度在1.0～3.4g/L范圍內(nèi)抑菌圈直徑同樣隨檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度提高而增大。但在培養(yǎng)基中較高乙酸鈉質(zhì)量濃度和較低檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度組合對(duì)抑菌圈直徑的增大有更強(qiáng)的正效應(yīng)。因此培養(yǎng)基中增加乙酸鈉質(zhì)量濃度，降低檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度有利于細(xì)菌素產(chǎn)量的提高。

圖3 乙酸鈉質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間交互影響抑菌圈直徑的響應(yīng)面及其等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots for inhibition zone diameter versus sodium acetate concentration and fermentation time

圖3 顯示了在葡萄糖質(zhì)量濃度45.0g/L和檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度4.0g/L時(shí)，乙酸鈉質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的交互影響效應(yīng)。在培養(yǎng)基中乙酸鈉質(zhì)量濃度較低(8.0g/L)時(shí)，抑菌圈直徑隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而縮小。而乙酸鈉質(zhì)量濃度較高(16.0g/L)時(shí)，抑菌圈直徑隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。即低質(zhì)量濃度乙酸鈉和較短的培養(yǎng)時(shí)間及高質(zhì)量濃度乙酸鈉和較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間是同樣的正效應(yīng)。因此，較低的乙酸鈉質(zhì)量濃度和較短的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)也可得到較高產(chǎn)量的細(xì)菌素。

圖4 檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間交互影響抑菌圈直徑的響應(yīng)面及其等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for inhibition zone diameter versus sodium citrate and fermentation time

圖4 顯示了在葡萄糖質(zhì)量濃度45.0g/L和乙酸鈉質(zhì)量濃度12.0g/L時(shí)，檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的交互影響效應(yīng)。在培養(yǎng)時(shí)間較短(36h)時(shí)，培養(yǎng)基中檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度在1.0～4.5g/L范圍內(nèi)，抑菌圈直徑隨檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度的提高而增大，隨后縮??；在培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)(60h)時(shí)，在培養(yǎng)基中檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度在1.0～3.5g/L范圍內(nèi)，抑菌圈直徑同樣隨檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度的提高而增大，隨后縮小。但前者的效應(yīng)有利于增大抑菌圈直徑，并且有利于縮短培養(yǎng)時(shí)間。因此，適當(dāng)提高檸檬酸三鈉水合物的質(zhì)量濃度有利于在較短培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)得到較高產(chǎn)量的細(xì)菌素。

總之，從提高發(fā)酵液細(xì)菌素產(chǎn)量和縮短生產(chǎn)周期要求考慮，提高培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度、降低乙酸鈉質(zhì)量濃度和適當(dāng)提高檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度有利于在較短的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)能得到產(chǎn)量較高的細(xì)菌素。

2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

鑒于嗜酸乳桿菌NX2-6產(chǎn)生細(xì)菌素模型的有效性，根據(jù)方程(2)預(yù)測(cè)結(jié)果選擇最理想的5組發(fā)酵條件(取值位于上述各因素試驗(yàn)水平范圍內(nèi))進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。對(duì)該模型方程求解得出在各因素分別為：葡萄糖質(zhì)量濃度60.0g/L、乙酸鈉質(zhì)量濃度8.0g/L、檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度5.0g/L及培養(yǎng)時(shí)間36h時(shí)，可獲得最大的抑菌圈直徑，預(yù)測(cè)值為21.37mm(表4)。利用SAS軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析得知，嗜酸乳桿菌NX2-6產(chǎn)生的細(xì)菌素抑菌圈直徑實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)系數(shù)R2為0.9918，證明此模型是有效的，并且該優(yōu)化后培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，發(fā)酵液抗菌活性增加約80.0%。因此，利用響應(yīng)曲面法對(duì)嗜酸乳桿菌NX2-6發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素條件進(jìn)行優(yōu)化具有一定的實(shí)用價(jià)值和指導(dǎo)意義。

表4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of validation experiments under optimal fermentation conditions

3 結(jié) 論

通過(guò)響應(yīng)曲面法對(duì)嗜酸乳桿菌NX2-6產(chǎn)細(xì)菌素具有顯著影響的葡萄糖質(zhì)量濃度、乙酸鈉質(zhì)量濃度、檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度以及培養(yǎng)時(shí)間的最佳組合水平建立了二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，探討了各因素間的交互作用，優(yōu)化了影響因素水平。對(duì)該模型方程求解得出在各因素分別為：葡萄糖質(zhì)量濃度60.0g/L、乙酸鈉質(zhì)量濃度8.0g/L、檸檬酸三鈉水合物質(zhì)量濃度5.0g/L及培養(yǎng)時(shí)間36h時(shí)，可獲得最大的抑菌圈直徑，預(yù)測(cè)值為21.37mm。此預(yù)測(cè)值被5組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，相關(guān)系數(shù)R2為0.9918，并且優(yōu)化條件下發(fā)酵液抗菌活性增加約80.0%。由此可見(jiàn)，利用響應(yīng)曲面法對(duì)嗜酸乳桿菌NX2-6產(chǎn)生細(xì)菌素起顯著影響因素的質(zhì)量濃度水平及發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化具有顯著效果。

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Optimization of Fermentation Conditions for Bacteriocin Production by Lactobacillus acidophilus NX2-6

WUYUNDALAI1,2，LU Zhao-xin1,*，F(xiàn)eng-xia1，BIE Xiao-mei1，LU Ya-ping1，SUN Hui-gang1，CHAGANQILAO1
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Three culture medium components including glucose, sodium acetate and sodium citrate and fermentation time were identified as key factors that affect bacteriocin production by Lactobacillus acidophilus NX2-6 using a Plackett-Burman design and their optimal levels were investigated using response surface methodology based on a Box-Behnken experimental desiign. The optimal levels of glucose, sodium acetate and sodium citrate concentrations and fermentation time were determined to be 60.0 g/L, 8.0 g/L, 5.0 g/L and 36 h, respectively based on the established quadratic polynormial regression equation for inhibition zone diameter of fermentaton broth. Under these conditions, the predicted inhibition zone diameter of fermentaton broth was 0.9918. The optimized culture medium resulted in an increase of approximately 80.0% in the antibacterial activity of fermentation broth compared to the basic culture medium. Therefore, response surface methodology can provide an economic, effective and reasonal strategy for the optimization of fermentation conditions for bacteriocin production by Lactobacillus acidophilus NX2-6.

L.acidophilus；bacteriocins；fermentation conditions；optimization

Q939.117

A

1002-6630(2012)03-0179-05

2011-03-04

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z357)

烏云達(dá)來(lái)(1975—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：wydl@imau.edu.cn

*通信作者：陸兆新(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：fmb@njau.edu.cn