員麗娟，史 茜，季新成，牛國輝

（1.新疆出入境檢驗檢疫局，烏魯木齊，830063；2. 新疆計量測試研究院，烏魯木齊，830011）

新孢子蟲病（Neosporosis）是由犬新孢子蟲（Neospora caninum）寄生在宿主體內(nèi)的一種原蟲病，垂直傳播是該病最主要的傳播途徑，是造成奶牛流產(chǎn)、產(chǎn)弱胎、死胎、木乃伊胎的主要原因之一，給畜牧業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失[1-2]。我國也有該病發(fā)生的報道[3]。迄今為止，還沒有防治新孢子蟲病的有效藥物和疫苗，準(zhǔn)確快速的檢測方法對于該病的防控至關(guān)重要。

熒光PCR方法具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，國外已有很多應(yīng)用該方法對新孢子蟲病進行檢測的報道[4-5]，國內(nèi)尚無該方面的研究。本研究建立了檢測新孢子蟲病的熒光PCR方法，為該病的精確、快速檢測提供了新的技術(shù)手段。

1 材料

1.1 陽性核酸和臨床樣品 新孢子蟲陽性核酸和剛地弓形蟲陽性核酸由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉群教授惠贈；含有牛新孢子蟲NC-5基因的陽性核酸由新疆出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心實驗室構(gòu)建保存；牛傳染性牛鼻氣管炎、牛環(huán)形泰勒蟲、牛瑟氏泰勒蟲和牛伊氏錐蟲等病原陽性核酸樣品由新疆出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心實驗室保存；?？鼓土鳟a(chǎn)胎兒組織病料等樣品采自新疆不同牛場。

1.2 主要試劑及儀器 全血基因組DNA提取試劑盒（DP1102）、DNAzol基因組DNA快速提取試劑（DP3002）為百泰克公司產(chǎn)品；pMD18-T載體（D101A）、凝膠純化回收試劑盒、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、DL 2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；引物、探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

ABI7300熒光PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；常規(guī)PCR儀為Biometra公司產(chǎn)品；Lambda35紫外分光光度計為PE公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 引物和探針的設(shè)計 根據(jù)N.Caninum的Nc-5基因序列（登錄號：X84238.1）設(shè)計擴增出138 bp的特異性引物2條（Np和Nr）和探針1條（NTpro），序列分別為：Np：5'-GTG GTT TGT GGT TAG TCA TTC G-3'，Nr：5'-GCA TAA TCT CCC CCG TCA TCA G-3'，NTpro：5'-FAM- CAC GTT GAA ATC AGC CTG CGT CAGECLIPSE -3'。

2.2 模板DNA的制備 抗凝全血按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作；流產(chǎn)胎兒組織先經(jīng)液氮研磨，然后按照百泰克公司的DNAzol基因組提取試劑說明進行操作。

2.3 熒光PCR擴增反應(yīng)條件的優(yōu)化 以已知陽性核酸為模板，以Np、Nr、NTpro為引物和探針進行擴增，Mg2+濃度分別為1.0～4.0mmol/L，dNTP濃度分別為0.1～0.4mmol/L，引物濃度分別為0.2～0.8mmol/L，探針濃度分別為0.1～0.4mmol/L，Taq DNA 聚合酶分別為0.75～1.5 u，Tm為59～61 ℃，循環(huán)參數(shù)分別為40、45和50，優(yōu)化一項時其他參數(shù)不變。

2.4 特異性檢測 用優(yōu)化后的熒光PCR方法分別對牛傳染性牛鼻氣管炎病毒、剛地弓形蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、牛瑟氏泰勒蟲和牛伊氏錐蟲等核酸進行擴增。每次擴增反應(yīng)同時設(shè)雙蒸水作陰性對照和牛新孢子蟲作陽性對照，以驗證方法特異性。

2.5 靈敏性檢測 以109～100拷貝/反應(yīng)系列梯度的重組質(zhì)粒為模板，用本研究建立的熒光PCR方法進行檢測。熒光PCR以出現(xiàn)S型擴增曲線，Ct<40，且陰性對照和空白對照均沒有S型擴增曲線和Ct值，作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，以結(jié)果為陽性的最高稀釋度作為檢測靈敏度。

2.6 重復(fù)性檢測 對107、105和103拷貝/反應(yīng)的重組質(zhì)粒進行3次重復(fù)性擴增，以驗證方法的重復(fù)性。

2.8 臨床樣品的檢測 對采自牛新孢子蟲病流行區(qū)的50份全血和8份流產(chǎn)胎兒腦組織用本研究建立的熒光PCR方法和二溫式PCR方法進行檢測[6]。

3 結(jié)果

3.1 熒光PCR反應(yīng)條件建立 25 μL反應(yīng)體系，其中Mg2+1.5mmol/L，dNTP 各0.2mmol/L，引物各0.4mmol/L，探針0.2mmol/L，Taq酶1.25 u，模板 1 μL，擴增條件為50 ℃，2 min，1個循環(huán)；95 ℃，5 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，57 ℃ 45 s，45個循環(huán)。擴增曲線見圖1。

3.2 方法的特異性檢測 通過對剛地弓形蟲、牛傳染性牛鼻氣管炎病毒、牛環(huán)形泰勒蟲、牛瑟氏泰勒蟲和牛伊氏錐蟲等核酸樣品進行擴增，檢測結(jié)果均為陰性，說明該方法具有良好的特異性。

3.3 方法的靈敏度檢測 經(jīng)對109～100拷貝/反應(yīng)系列梯度的重組質(zhì)粒進行熒光PCR 擴增，可檢測到101拷貝/反應(yīng)的重組質(zhì)粒（圖2）。并繪制擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線 （圖3）。在所測的濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與對應(yīng)的Ct值呈現(xiàn)明顯的線性相關(guān)關(guān)系，其回歸曲線的斜率為-3.083，截距為42.052，相關(guān)系數(shù)R2為0.997。

3.4 方法的重復(fù)性檢測 分別對107、105和103拷貝/反應(yīng)的重組質(zhì)粒進行3次重復(fù)性擴增檢測，不同試驗獲得的Ct值變異系數(shù)為0.50%～1.18%，表明該方法具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性（圖4）。

3.5 對臨床樣品的檢測 對采自牛新孢子蟲病流行區(qū)的50份全血和8 份流產(chǎn)胎兒腦組織進行檢測，本研究建立的熒光PCR方法的陽性檢出率均為10.3%（其中全血5份，流產(chǎn)胎兒1份），二溫式PCR方法的陽性檢出率為7%（其中全血3份，流產(chǎn)胎兒1份），表明該熒光PCR具有較高的檢測靈敏度。

4 討論

PCR方法具有快速、準(zhǔn)確且操作簡便等優(yōu)點，是目前對新孢子蟲病進行快速檢測的常用方法[7-8]。熒光PCR是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的檢測技術(shù)，與普通PCR方法相比較，不需電泳，可有效減少污染的發(fā)生，并能進一步提高檢測的靈敏度和特異性[4-5]。目前，國內(nèi)還沒有應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測該病的報道。

Nc-5基因是新孢子蟲基因組中最為保守的基因，且該基因僅存在于犬新孢子蟲基因組中[9]。本研究以該基因為研究對象，設(shè)計特異性引物和探針，進一步增加了方法的特異性。該方法能夠檢測10個拷貝/反應(yīng)的核酸分子，與普通PCR相比較，進一步增加了檢測結(jié)果的靈敏度，該方法具有較好的可重復(fù)性，通過對臨床樣品的檢測，具有較好的應(yīng)用效果。

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