賈 寧，孫榮釗

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

細胞凋亡是機體在生理條件下受到內(nèi)外信號刺激時，啟動由細胞本身主動調(diào)控的具有一定程序的死亡，故又稱程序性細胞死（programmedcelldeath，PCD）。在多細胞生物當中，細胞的死亡有兩種不同的方式：一種是壞死性或事故性損傷，它是由于某些外界的因素，如貧血、理化因素、缺氧、pH值低下、高熱或其他理化創(chuàng)傷因子的作用下造成細胞急速死亡而造成不可逆的損傷；另一種溫和的細胞死亡形式稱為細胞凋亡，它是由基因編碼的細胞程序性死亡過程。細胞凋亡是機體對外界刺激進行的主動應(yīng)答，這對于維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、免疫系統(tǒng)正常功能、調(diào)控機體發(fā)育等具有著重要意義。

1972年Kerr等[1]首先用細胞凋亡（apoptosis）這一術(shù)語來描述細胞死亡的另一種方式，其在發(fā)生機制和形態(tài)特征上與細胞壞死（necrosis）不同。越來越多的資料表明病毒感染能誘導(dǎo)宿主細胞凋亡[2]。病毒誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，限制病毒復(fù)制，可以看作宿主一種細胞水平的病毒防御機制；病毒基因或因病毒感染誘導(dǎo)表達的細胞蛋白抑制了凋亡，造成持續(xù)性感染以及潛伏感染，導(dǎo)致機體長期帶毒而無明顯的臨床癥狀。

1981年Ezoe等[3]用能產(chǎn)生Cyt/Dey的腺病毒突變體感染細胞，伴隨著宿主細胞和病毒DNA降解，細胞迅速死亡，這是病毒感染誘導(dǎo)細胞凋亡研究的首次報道。試驗表明：病毒感染誘發(fā)的細胞凋亡常與一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，研究病毒感染宿主細胞后調(diào)節(jié)細胞凋亡的機制不僅有助于深入理解病毒的致病機理和開發(fā)新的抗病毒制劑，還為探索細胞內(nèi)分子事件打開了窗口。這些研究對治療人類病毒性疾病意義深遠。

1 細胞凋亡的功能

細胞凋亡的主要功能是清除那些對整個機體有害的細胞，為抵抗病毒感染和癌癥發(fā)生提供一種機制。病毒感染細胞通常被病毒專一性淋巴細胞或由某些細胞因子啟動的細胞凋亡程序識別并摧毀。一些病毒在感染期間直接誘導(dǎo)細胞凋亡。與此同時，許多病毒為了有利于自身的復(fù)制而得到更多的子代，已進化出阻礙細胞凋亡并延長宿主細胞歷期的機制。由于病毒是一類分子生物，病毒蛋白以分子形式參與細胞凋亡的調(diào)控，利用病毒與細胞相互作用研究細胞凋亡調(diào)控的生化途徑具有重要意義。

2 病毒感染調(diào)控細胞凋亡的機制

一般來說，病毒調(diào)節(jié)靶細胞凋亡的途徑主要有兩種：經(jīng)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)或病毒本身具有凋亡調(diào)節(jié)基因；病毒凋亡調(diào)節(jié)基因通過模仿或調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑中某些保守成份而發(fā)揮作用。細胞調(diào)亡調(diào)控的生化途徑實際上是一個信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，對于這一系統(tǒng)的研究現(xiàn)已取得了很大進展。

2.1 經(jīng)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)細胞凋亡

病毒感染可激活CTL介導(dǎo)細胞凋亡，CTL對清除動物體內(nèi)病毒具有重要意義。CTL主要通過兩條途徑殺死已被病毒感染的細胞。（1）通過分泌穿孔素和顆粒酶。在MHCⅠ類抗原誘導(dǎo)之下，CTL與被病毒感染的細胞結(jié)合，首先是穿孔素顆粒釋放，繼而進入靶細胞胞膜，在胞膜中生成小孔，顆粒酶進入靶細胞。在此過程中，顆粒酶B激活I(lǐng)CE樣蛋白酶，后者特異性地切斷DNA依賴的蛋白激酶催化亞單位（DNA-PKcs），其被切斷后引起DNA損傷后的修復(fù)障礙。同時，顆粒酶B切斷Caspase-3，產(chǎn)生可降解PARP（Poly（ADP-ribose）polymerase）的活性產(chǎn)物，PARP的活性產(chǎn)物又能激活Caspase-3的蛋白水解作用。（2）通過上調(diào)Fas/FasL基因表達，激活磷酸酯酶，合成神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺進一步激活絲/蘇蛋白激酶，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活細胞凋亡。另據(jù)國外報道，CTL細胞上蛋白酶gzmA和gzmb及穿孔素與細胞凋亡關(guān)聯(lián)性較高，使用體外病毒免疫的CTL和具有抗Fas的EL4.F15作為靶細胞進行研究顯示：gzmA（+）或gzmb（+）的CTL誘導(dǎo)EL4.F15細胞出現(xiàn)早期凋亡特征。再者，凡有g(shù)zm介導(dǎo)的細胞凋亡特征均不同程度的與穿孔素有關(guān)，穿孔素明顯影響了CTL和gzm發(fā)揮作用[4]。Sabri等[5]研究發(fā)現(xiàn)病毒活化的CTL還可通過分泌因子誘導(dǎo)星形神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生凋亡，并且TNF-α和IFN-α對于CTL因子誘導(dǎo)的細胞凋亡有協(xié)同作用。

2.2 病毒直接調(diào)節(jié)凋亡

2.2.1 抑制細胞凋亡的病毒蛋白

目前已發(fā)現(xiàn)20種以上病毒蛋白能抑制細胞凋亡，這些病毒蛋白來源不同，調(diào)控機制各異。隨著國內(nèi)外研究工作的深入，未來會發(fā)現(xiàn)更多的病毒蛋白能影響細胞凋亡的生化途徑（表1）。

表1 抑制細胞凋亡的病毒蛋白

2.2.2 促進細胞凋亡的病毒蛋白

病毒感染宿主細胞后，有機體的反應(yīng)之一就是通過細胞凋亡清除那些被感染的有害細胞，病毒蛋白引發(fā)細胞凋亡是病毒感染過程中的普遍現(xiàn)象。目前已確定多種病毒蛋白能引發(fā)細胞凋亡（表2）。

表2 促進細胞凋亡的病毒和病毒蛋白

3 病毒感染相關(guān)的細胞凋亡分子

3.1 53途徑

又稱抑癌蛋白或腫瘤抑制基因，分子量為53kD，分為野生型和突變型。野生型p53促進細胞凋亡，p53突變體則抑制細胞凋亡。p53是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它能促進多種基因的表達，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。

Devireddy等研究牛單純皰疹病毒I型感染外周血單核細胞發(fā)現(xiàn)，病毒感染細胞后p53數(shù)量和活性增高，并且刺激激活p21和Bax，同時激活Caspase，后者作用其底物PARP、actin及切斷抑制凋亡的Bce-lxL，誘導(dǎo)細胞凋亡。

KomotoS等[6]研究發(fā)現(xiàn)人免疫缺陷病毒Ⅰ型通過p53的表達誘導(dǎo)T細胞凋亡。

erradillos等[7]發(fā)現(xiàn)，p53雖然可以促進細胞凋亡，但不是細胞凋亡的必要條件。例如：乙型肝炎病毒的HBx蛋白誘導(dǎo)細胞凋亡就是非p53依賴性的。

3.2 Caspases家族

Caspase（cysteinylaspartate-specificproteinase，Caspase）譯名為半胱氨酸天冬氨酸酶，簡稱為半胱天冬酶。它是一組系列化蛋白酶的總稱，國外報道稱目前發(fā)現(xiàn)有13種以上，分別命名為Caspase-1、Caspase-2等，它們都是ICE/CED-3的同源物。Caspase中的“C”代表這種蛋白酶具有半胱氨酸（Cysteine）蛋白酶活性，“aspase”表示其在天冬氨酸（asparicacid）后切割蛋白。激活的Caspase可作用于其自身和其他Caspase酶原，按一定順序激活Caspase，激活的Caspase作用于不同底物，能夠加快細胞凋亡。生長因子的撤除、受體配體的作用、藥物作用及病毒感染，這些誘發(fā)細胞死亡的刺激均可激活Caspase。

現(xiàn)已經(jīng)證實豬傳染性胃腸炎病毒通過caspase-6、caspase-7來發(fā)揮作用；雞傳染性支氣管炎病毒通過caspase-3發(fā)揮作用。CarrascosaAL等[8]證實了非洲豬瘟病毒誘導(dǎo)Vero細胞凋亡的過程中伴隨著caspase-3的激活。

3.3 Fas/FasL系統(tǒng)

Fas又稱APO-1或CD95，是Ⅰ型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體（TNFR/NGFR）超家族，其與TNFR、NGFR、CD27、CD30等約有30%的同源性，F(xiàn)asL、屬TNF家族成員，是Ⅱ型跨膜蛋白。Fas相關(guān)蛋白（FADD）是存在于胞質(zhì)中的一種蛋白質(zhì)，在凋亡信號刺激下，F(xiàn)as與其受體FasL結(jié)合，然后Fas的死亡域（DD）與FADD死亡域結(jié)合，誘導(dǎo)FADDN端的死亡效應(yīng)區(qū)（DED）與pro-caspase8（或pro-caspase10）中的DED結(jié)合，形成一個新的死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物——（DISC）。該復(fù)合物能解除分子自我抑制、形成活化的異四聚體，使下游pro-Caspase水解活化，再通過一系列Caspase級聯(lián)激活反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

病毒感染介導(dǎo)細胞表達Fas/FasL，或上調(diào)Fas、FasL的表達，促進細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)：HIV感染人巨噬細胞后，可經(jīng)病毒直接作用或病毒感染產(chǎn)生的細胞因子及可溶性病毒蛋白間接作用，介導(dǎo)巨噬細胞FasL表達增加，且FasL表達程度與體內(nèi)組織細胞凋亡密切相關(guān)[9]。Nicho1s等[10]分析了流感病毒感染后的淋巴細胞亞群，CD4+、CD8+、CD19+淋巴細胞均出現(xiàn)了凋亡，而且凋亡細胞表面高表達FasL，非凋亡細胞低表達FasL，當加入抗Fas、FasL抗體共同培養(yǎng)后，細胞凋亡顯著減少。流感病毒誘導(dǎo)細胞凋亡的機制可能是：感染刺激機體產(chǎn)生IFN-γ、IFN-β和dsRNA，它們均可提高Fas表達，F(xiàn)as與表達在CTL或其他細胞上的FasL結(jié)合形成三聚體后，一方面依次激活蛋白激酶途徑、三磷酸肌醇和二?；视屯緩揭约扳}信號途徑激Ca2+/Mg2+依賴性核酸酶，導(dǎo)致DNA斷裂和染色質(zhì)固縮；另一方面，通過Fas的FADD活化Caspase途徑，依次激活蛋白酶鏈裂解各種底物以誘導(dǎo)細胞凋亡。Shin等[11]通過HBV基因組HBX、和突變的HBX基因轉(zhuǎn)染PLC/PRF/5肝癌細胞，在HBV或HBX轉(zhuǎn)染的PLC/PRF/5細胞檢測到了FasL的表達，而突變的HBX轉(zhuǎn)染的PLC/PRF/5細胞沒有檢測到FasL的表達，證實HBV的X基因在誘導(dǎo)肝癌細胞FasL的表達中起了重要作用。Yoo等[12]研究發(fā)現(xiàn)HBX蛋白可以增強Egr-2和Egr-3的轉(zhuǎn)錄活動和反式激活功能，進而增強FasL的轉(zhuǎn)錄活性，反義Egr-2、Egr-3，可以抑制FasL的表達。另有研究發(fā)現(xiàn)，HBX的羧基端對于FasL和Egr的轉(zhuǎn)錄活化是必不可少的。

3.4 TRAIL

TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）屬于Ⅱ型跨膜糖蛋白，與其結(jié)合的受體有5個：DR4、DR5、DcRl、DcR2、OPG。其中，DR4和DRS被認為是轉(zhuǎn)導(dǎo)TRAIL凋亡信號受體，TRAIL與受體結(jié)合后可激活NF-κB、JNK通路和caspase級聯(lián)反應(yīng)，進而介導(dǎo)細胞凋亡。Huang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，雞新城疫病毒（NDV）可通過TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡。Liang等[14]通過建立3種細胞模型：肝癌細胞株BEL7402、BEL7402-HBX（將包含HBX基因的pcDANHBX轉(zhuǎn)染BEL7420獲得）和對照細胞BEL7420-cDNA（轉(zhuǎn)染了pc-DAN3的BEL7420細胞），針對HBX與TRAIL的關(guān)系進行一系列試驗，得出結(jié)論：BEL7402，BEL7402-HBX，BEL7402-cDAN3種細胞與TRAIL存在一個劑量依賴的細胞毒作用，在濃度相同的條件下，通過TRAIL處理，BEL7402-HBX的凋亡率及對capase-3的活化率比其他2種細胞具有更高水平。

以往的觀點認為TRAIL通常只引起腫瘤及轉(zhuǎn)化細胞的凋亡，對正常細胞不敏感，但最近對HIV-1研究表明，TRAIL還介導(dǎo)了神經(jīng)元細胞和CD4+T細胞的凋亡[15]。

3.5 bcl-2基因家族

B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcelllymphoma/leukemia-2，bcl-2）是凋亡研究中最受重視的癌基因之一。bcl-2家族包括抑制凋亡的bcl-2、bcl-XL、mcl-1、A1和ced-9等，促進凋亡的bax、bad和bcl-Xs等成員。它們相應(yīng)的cDNA編碼Bcl-2蛋白家族均有BH1和BH2兩個高度同源序列。BH1和BH2同源結(jié)構(gòu)域是Bcl-2家族成員形成同型或異型二聚體并參與細胞凋亡調(diào)節(jié)的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。bcl-2正常表達可使許多細胞免于凋亡，但bcl-2抑制凋亡具體作用機制尚不清楚，因受多種不同信號刺激趨于凋亡的細胞均可被bcl-2表達所補救，故推測bcl-2可能于凋亡后期某個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。研究表明，bcl-2/Bax兩蛋白之間的比例是決定對細胞凋亡抑制或促進的關(guān)鍵因素。HIV的gp120與CD4交聯(lián)后，選擇性降低bcl-2表達，對HIV介導(dǎo)CD4+T細胞凋亡是必須的。Jackson等研究發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒感染小鼠引起神經(jīng)元Bax表達升高，使bcl-2/Bax比例失調(diào)，從而介導(dǎo)細胞凋亡。

3.6 TNF-α/TNFR-1途徑

腫瘤壞死因子（TNF-α）屬TNF家族成員，它是一種主要由單核巨噬細胞分泌的具有多種生物學(xué)活性的多肽調(diào)節(jié)因子。其受體TNFR1和TNFR2存在于多種細胞表面。TNFR1與Fas在結(jié)構(gòu)上同源，若激活可誘導(dǎo)細胞凋亡。TNFR2則不參與細胞凋亡。TNF-α與TNFR1結(jié)合后，使TNFR1的死亡結(jié)構(gòu)域與受體作用蛋白（RIP）和TNFR1相關(guān)蛋白（TRADD）結(jié)合，然后RIP的死亡結(jié)構(gòu)域再結(jié)合RIP相關(guān)半胱氨酸同源蛋白，繼而將pro-caspase2激活，繼之激活pro-caspase8，最后通過caspase的級聯(lián)激活反應(yīng)導(dǎo)致靶細胞凋亡。

3.7 細胞因子介導(dǎo)的細胞凋亡

細胞因子是免疫細胞或某些基質(zhì)細胞合成的一種異質(zhì)性肽類調(diào)節(jié)因子，與細胞凋亡有關(guān)的細胞因子主要有神經(jīng)生長因子（NGF）、干擾素（IFN）、腫瘤壞死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）及轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）等[16]。

3.7.1 TGF途徑

轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）分為TGF-α和TGF-β兩種。TGF-β既能增強某些細胞的增殖、分化能力，又能誘導(dǎo)某些細胞的凋亡反應(yīng)。

病毒感染靶細胞后，可使TGF-β數(shù)量及活性會增高，加速了凋亡發(fā)生。Lin等[17]在對馬流感病毒感染MDCK細胞研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1表達增加，從而激發(fā)JNK/SAPK信號途徑介導(dǎo)細胞凋亡。研究顯示TGF-β的凋亡與Bcl-2表達減少、caspase3表達增加有關(guān)。Schultz等[18]研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒NA具有唾液酸酶作用，病毒感染細胞后，NA裂解TGF-β前體上的唾液酸殘基，釋放成熟的TGF-β，使得細胞表而或細胞外基質(zhì)中TGF-β活性增強，造成細胞凋亡發(fā)生。

3.7.2 IFN途徑

IFN介導(dǎo)細胞凋亡最主要方式是通過激活PKR，高表達Fas來實現(xiàn)。IFN-γ還能誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生NO，NO反過來又能協(xié)同IFN-γ導(dǎo)致巨噬細胞凋亡。Zhirnov等[19]試驗證明：病毒對IFN合成功能不同的細胞誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)明顯不同，因此推測，病毒誘導(dǎo)細胞凋亡機制與IFN抗病毒作用機制相關(guān)聯(lián)。此外，還發(fā)現(xiàn)流感病毒蛋白NS1誘導(dǎo)細胞凋亡作用也依賴IFN。

4 結(jié)語

病毒感染能引起細胞凋亡或程序性死亡。隨著專家們對這一機制研究的深入，這種論斷已漸漸清晰。病毒感染介導(dǎo)細胞凋亡，是一把雙刃劍。它既是機體對周圍未感染細胞的一種保護性機制，亦是細胞在病毒感染后，一些病毒蛋白引發(fā)細胞凋亡、迅速導(dǎo)致宿主組織細胞損傷的重要機制。這一機制被一些科研工作者所利用，即使用一些病毒，如腺病毒、狂犬病毒、皰疹病毒等“以毒攻毒”，借助病毒裂解惡性腫瘤細胞，取得了可觀的成果。

目前，有關(guān)這方面的探索極為迅速。而開發(fā)多種新方法治療臨床一些棘手的病癥，把促進凋亡與抑制凋亡的這些病毒產(chǎn)物或模擬其功能的制劑應(yīng)用于病毒感染不同階段，這具有非常重要的現(xiàn)實意義。相信在不久的將來，還會揭示更多未知的細胞凋亡調(diào)節(jié)機制，這些機制會讓人們從更全面的角度理解病毒與宿主的關(guān)系。

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