吳 娟，秦曉冰，單 虎

（青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109）

近年來，隨著集約化養(yǎng)殖，由水貂綠膿桿菌（銅綠假單胞菌）（Pseudomonas aeruginosa，PA）導致的水貂出血性肺炎常表現(xiàn)為群體性急性暴發(fā)，水貂前期咳嗽，后期體溫升高，呼吸困難，口鼻流血，死亡率逐年增高。綠膿桿菌對外界的抵抗力極強，由于臨床治療中抗菌藥物的廣泛使用，不合理應(yīng)用，甚至濫用及畜牧業(yè)中飼料不恰當添加等，導致綠膿桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥譜不斷擴大，形成惡性循環(huán)，同時也加劇了抗菌藥物在水貂體內(nèi)的殘留，嚴重威脅我國皮毛業(yè)的發(fā)展，并對人類的身體健康帶來了潛在危害。我國養(yǎng)殖業(yè)中的綠膿桿菌耐藥情況已是十分嚴重，且呈現(xiàn)多重耐藥特性[1-2]。因此獲得一種理想的疫苗來預(yù)防水貂綠膿桿菌病顯得尤為重要。

細菌鞭毛（f l agella）是細菌的運動器官并與細菌的生存密切相關(guān)[3]，鞭毛具有不耐熱性抗原，在細菌致病過程中，鞭毛也直接參與細菌與宿主的粘附、感染與致病等過程，是細菌最重要的致病因子，而鞭毛蛋白是其主要的組成元件[4-5]。

綠膿桿菌的致病性與其產(chǎn)生多種毒力因子息息相關(guān)，毒素是綠膿桿菌致病的物質(zhì)基礎(chǔ)。綠膿桿菌主要有3類毒素，即粘附因子、內(nèi)毒素（LPS）、胞外產(chǎn)物。細菌粘附于宿主細胞表面是對機體感染致病的先決條件，對細菌侵入宿主并有效發(fā)揮毒素等的作用具有重要意義[6]。鞭毛就是一種重要的粘附因子，毒力實驗表明綠膿桿菌鞭毛是動物感染過程中的一個毒力細胞器.鞭毛不僅與運動有關(guān)，更重要的是在感染與免疫以及分類鑒定等方面發(fā)揮重要的作用，特別是免疫原性具有重要的實際意義。Yancey將粗制鞭毛于100℃加熱15 min，破壞其蛋白成分后再免疫動物，結(jié)果其保護力喪失，這提示鞭毛中的保護性抗原是鞭毛蛋白[7]。綠膿桿菌鞭毛蛋白不僅可以激發(fā)機體的體液免疫，還可以引起細胞免疫，具備作為優(yōu)良亞單位疫苗的主要特點。

綠膿桿菌屬于革蘭氏陰性菌， 綠膿桿菌鞭毛為極端鞭毛呈單個或成對排列，由蛋白質(zhì)構(gòu)成，是重要的表面抗原，不同血清型間有相同的鞭毛蛋白免疫原，產(chǎn)生免疫保護作用[8]，為疾病的診斷提供了特異性抗原，水貂SD03PA株血清型為F型，鞭毛呈b型，大部分水貂均感染此類型菌株而發(fā)病。

菌鞭毛蛋白的分離已有報道，包括細菌擴大培養(yǎng)后，收集細菌用不同方法使其從菌體脫落，然后純化。但分離過程中可能由于培養(yǎng)基帶來其他蛋白，裂菌時菌體破裂釋放蛋白，甚至造成需要提取的鞭毛蛋白部分變性。為提高所培養(yǎng)細菌的產(chǎn)量，同時保持其穩(wěn)定的理化特性，我們對提取方法做了簡單改良：采用不同的酸堿度使鞭毛蛋白從菌體脫落，并結(jié)合機械振蕩法，用（NH4）2SO4鹽析獲得鞭毛蛋白。結(jié)果更易得到產(chǎn)量高、純度高的樣品，節(jié)約了成本和時間，也為下一步鑒定提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司；低分子量蛋白標準購自TaKaRa公司。

1.1.2 菌株 水貂綠膿桿菌（PASD03株）（由實驗室從患病水貂臟器中分離純化，鑒定并保存所提供），由標準菌株ATCC 27853 （山東省農(nóng)科院提供）質(zhì)控所得。

1.1.3 主要儀器 臺式超高速冷凍離心機SIGMA3K30（北京博勱行儀器有限公司）；渦旋振蕩器（上海滬西儀器廠）；DELTA320電子pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)）；微型垂直板電泳槽（北京市六一儀器廠）；CL-1A磁力攪拌器（上海一科儀器設(shè)備有限公司）；JEM-1200 EX型透射電鏡（日本JEOL公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 將肉湯培養(yǎng)液中培養(yǎng)好的綠膿桿菌接種到瓊脂表面（大培養(yǎng)皿每個加1 mL，小培養(yǎng)皿加30 μL），37 ℃培養(yǎng)17～30 h后，用玻璃棒刮取菌苔，適量生理鹽水重懸。

1.2.1.2 將培養(yǎng)好的菌株接種到500 mL肉湯中，放入恒溫搖床中，轉(zhuǎn)速120 r/min，37 ℃孵育12～16 h。

1.2.2 酸解法提取綠膿桿菌鞭毛蛋白

將1.2.1培養(yǎng)好的菌株4 ℃ 6000 r/min離心30 min收集細菌，PBS洗三次，加入1 mol/L鹽酸調(diào)至pH2.0，室溫磁力攪拌30 min裂解細菌，4 ℃ 10000 r/min離心1 h后，去除菌體，取上清4 ℃ 20000 r/min離心1 h，去雜質(zhì)，上清液用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH7.2，冰浴30 min，將上清置磁力攪拌器上緩緩加入飽和硫酸銨溶液，至飽和度67%，4 ℃過夜15000 r/min離心30 min，沉淀用生理鹽水透析48 h后，少量分裝-20 ℃凍存。

1.2.3 差速離心法提取綠膿桿菌鞭毛蛋白

將1.2.1中培養(yǎng)好的菌株4 ℃離心5000r/min離心30 min。PBS洗三次，菌團懸浮于PBS中，置攪拌器內(nèi)攪拌30 min以裂解細菌，再于4 ℃以16000 r/min離心15 min。取上清以40000r/min離心3h，取沉淀，混懸于少量PBS中，生理鹽水透析48 h，少量分裝-20 ℃凍存。

1.2.4 酸解法結(jié)合機械振蕩提取綠膿桿菌鞭毛蛋白

將1.2.2中用1 mol/L鹽酸調(diào)至pH2.0后所得到的菌液，加入等量無菌玻璃渣于旋渦振蕩器上劇裂震蕩30 min，4 ℃以10000 r/min離心1 h，去除菌體和雜質(zhì)，取上清液于4 ℃以40000 r/min離心1 h，上清用1 mol/LNaOH溶液調(diào)pH7.2，冰浴30 min，將上清置磁力攪拌器上緩緩加入飽和硫酸銨溶液，至飽和度67%，4 ℃過夜，15000 r/min離心30 min，沉淀用生理鹽水透析48 h后，SDS-PAGE電泳實驗以及電鏡觀察并少量分裝-20℃凍存。

1.2.5 SDS-PAGE電泳實驗分析鞭毛蛋白

1.2.5.1 組裝模具 將已清洗干凈的兩塊玻璃板用封條封嚴，組裝在電泳架上，然后固定結(jié)實。

1.2.5.2 制膠[9-10]

配制10 mL 12%分離膠：水3.3 mL，30%丙烯酰胺—雙丙烯酰胺4.0 mL，1.5 mol/L Tris（pH8.8） 2.5 mL，10%（W/V）SDS 0.1 mL，10%W/V）過硫酸銨0.1 mL，TEMED 0.004 mL.

配制2 mL 5%濃縮膠：水1.4 mL，30%丙烯酰胺—雙丙烯酰胺0.33 mL，1mol/L Tris（pH 6.8）0.25 mL，10%（W/V）SDS 0.02 mL，l0%（W/V）過硫酸銨0.02 mL，TEMED 0.002 mL。

1.2.5.3 點樣

將蛋白樣品與2×SDS凝膠加樣緩沖液按1：1混和，沸水中加熱 5 min上樣，每孔加樣20 μL。

1.2.5.4 電泳

連接好電源正負極導線，80 V恒壓電泳至溴酚蘭進入分離膠后，120 V電泳直至指示劑遷移至接近膠底1 cm時停止電泳。

1.2.5.5 染色與脫色

用考馬斯亮藍R-250染色，置室溫搖床搖3～4 h，再將凝膠放入脫色搖床中脫色6～10 h，期間更換脫色液2～3次，觀察蛋白電泳情況。

1.2.6 鞭毛蛋白鏡檢

電鏡負染試驗，采用漂浮法[11]。將提純鞭毛蛋白樣品滴于干凈載玻片上，再將覆有Formvar銅網(wǎng)漂浮于樣品滴上沾取樣品3 min，用鑷子取出后，37 ℃放置干燥15 min，再將銅網(wǎng)漂浮于pH7.0 磷鎢酸液滴染色5 min，用濾紙吸去多余的染液，晾干后，使用電鏡JEM-1200觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法結(jié)果比較

3種方法提取的鞭毛蛋白各20 μL進行SDSPAGE，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，酸解法結(jié)合機械振蕩法提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示只有一條清晰的蛋白條帶，且蛋白分子量為53 kD，經(jīng)紫外分光光度計測得其蛋白濃度為1.0 mg/mL；酸解法提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白，為0.53 mg/mL；差速離心法提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白，為0.15 mg/mL。

并經(jīng)Quantity one軟件分析可得，酸解法結(jié)合機械振蕩法提取得到的綠膿桿菌鞭毛蛋白占有率為86.9%（圖1，泳道2），酸解法提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白占有率為50.1%（圖1，泳道1），差速離心得到的綠膿桿菌鞭毛蛋白占有率僅為14.6%（圖1，泳道3）。

因此與后兩種方法相比，酸解法結(jié)合機械振蕩法提取得到的鞭毛樣品中有雜帶出現(xiàn)，說明經(jīng)此方法獲得的鞭毛蛋白樣品中含有雜蛋白。

2.2 鞭毛蛋白的鏡檢結(jié)果

經(jīng)酸解法結(jié)合機械振蕩法得到的鞭毛蛋白樣品做透射電鏡觀察，結(jié)果如圖2所示。

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該蛋白呈經(jīng)典的絲狀，與其他學者報道的鞭毛蛋白形態(tài)相同，說明該蛋白就是鞭毛蛋白，且圖中并沒有明顯的菌體和其他雜質(zhì)的存在，由此可以說明經(jīng)酸解法結(jié)合機械振蕩法得到的鞭毛蛋白是可行的。

3 討論

綠膿桿菌鞭毛為極端鞭毛呈單個或成對排列，其鞭毛具有很重要的理化特性，它的免疫原性在生物學和致病機制研究中具有重要的意義[12]。在提取鞭毛蛋白時，需要考慮以下兩個方面的問題：一是培養(yǎng)綠膿桿菌時鞭毛存在的最佳培養(yǎng)條件，二是綠膿桿菌鞭毛的脫落方法。

實驗中培養(yǎng)菌時首先采用固體培養(yǎng)基，但后來發(fā)現(xiàn)有學者認為液體培養(yǎng)基較固體培養(yǎng)基更能刺激細菌高度增殖和鞭毛蛋白高產(chǎn)，單位質(zhì)量的細菌可提取更高產(chǎn)量的鞭毛蛋白，所以后來在培養(yǎng)菌時多采用液體培養(yǎng)基，且放入恒溫搖床中，轉(zhuǎn)速120 r/min，37 ℃孵育12～16 h。實驗結(jié)果表明這時段的鞭毛形態(tài)正常，并且用這種方式處理獲取的鞭毛蛋白純度較高。

1988年，Peel就利用菌體細胞與小玻璃珠產(chǎn)生切力作用使菌體與其鞭毛得到分離，即通過機械手段來完成鞭毛蛋白的提取[13]。Ibrahim等[14]運用酸解法獲得高純度的鞭毛蛋白。也有些研究者為追求鞭毛蛋白的產(chǎn)量，使用富含各種蛋白的培養(yǎng)基，于是給純化帶來麻煩，特別當培養(yǎng)基有和鞭毛蛋白分子量接近的蛋白質(zhì)時，很難使營養(yǎng)蛋白完全分離，很難獲得純化的蛋白，酸裂解法各方面的條件也很難控制[15]。本試驗對文獻中提取鞭毛蛋白的方法做了簡單改良，采用不同的酸堿度使鞭毛蛋白從菌體脫落，并結(jié)合機械振蕩法，用（NH4）2SO4鹽析獲得鞭毛蛋白，使提取的粗制蛋白相對較純，后面純化過程相對容易，從而得到高產(chǎn)量、高純度的蛋白。

通過SDS-PAGE電泳實驗結(jié)果可以觀察到，目的條指示的分子量為53 kD，另外，通過在透射電鏡下觀察到的鞭毛蛋白以及SDS-PAGE實驗結(jié)果，可以得出利用酸解法結(jié)合機械振蕩法提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白是具有現(xiàn)實價值的。

但是，用這種方法提取的鞭毛蛋白還不是很純，總體獲得率不是很高。因此，還需要進一步的探索，找到更好的方法獲得大量綠膿桿菌鞭毛蛋白。

綠膿桿菌鞭毛蛋白具有良好的免疫特異性，而且研究表明提取的鞭毛蛋白要比基因克隆表達的免疫特異性好很多[8]，因此具有十分重要的研究意義，對進一步研究這種鞭毛蛋白在動物中的抗原性，制備免疫血清，并分離提純抗原性強的鞭毛蛋白用以構(gòu)建抗病亞單位疫苗，真正為防治綠膿桿菌病提供切實可用的依據(jù)，為建立水貂養(yǎng)殖病害預(yù)防控制與健康養(yǎng)殖模式，有很強的實際應(yīng)用前景。

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