王樹鵬 郭曉東 李海波 張麗艷 曲道煒

加味小青龍湯臨床應(yīng)用治療變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)療效確切[1]，臨證中發(fā)現(xiàn)很多AR患者存在陽氣不足，水飲內(nèi)停之表現(xiàn)，加味小青龍湯具有益氣溫陽化飲之功用，為深入研究加味小青龍湯益氣溫陽化飲的作用機(jī)制和配伍規(guī)律，本課題組制備了變應(yīng)性鼻炎的大鼠模型，以AR大鼠血漿IL-4和鼻黏膜病理形態(tài)為指標(biāo)，對(duì)加味小青龍湯進(jìn)行拆方研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠90只，體重為200～240 g。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：2000量認(rèn)(遼)字(S2011)號(hào)。

1.2 分組方法

按照成組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，將大鼠按體重采用隨機(jī)區(qū)組法分為9組，每組10只。分別為：(1)正常對(duì)照組；(2)模型組；(3)益氣組(黃芪6 g、白術(shù)9 g、防風(fēng)6 g)；(4)溫陽組(麻黃9 g、桂枝9 g、白芍9 g、炙甘草9 g)；(5)化飲組(干姜9 g、細(xì)辛5 g、五味子9 g、半夏9 g)；(6)益氣溫陽組(黃芪6 g、白術(shù)9 g、防風(fēng)6 g、麻黃9 g、桂枝9 g、白芍9 g、炙甘草9 g)；(7)益氣化飲組(黃芪6 g、白術(shù)9 g、防風(fēng)6 g、干姜9 g、細(xì)辛5 g、五味子9 g、半夏9 g)；(8)溫陽化飲組(麻黃9 g、桂枝9 g、白芍9 g、炙甘草9 g、干姜9 g、細(xì)辛5 g、五味子9 g、半夏9 g);(9)加味小青龍湯組(麻黃9 g、桂枝9 g、白芍9 g、炙甘草9 g、干姜9 g、細(xì)辛5 g、五味子9 g、半夏9 g、黃芪6 g、白術(shù)9 g、防風(fēng)6 g)。

1.3 試驗(yàn)用藥

實(shí)驗(yàn)用中藥購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室鑒定均為正品。生藥劑量根據(jù)《傷寒論》小青龍湯原方劑量比例進(jìn)行配比。各治療組藥物煎煮后濃縮成含生藥量1 g/ml的濃縮液。

1.4 試劑與儀器

(1)試劑：卵白蛋白：上?；瘜W(xué)試劑廠(20090508)。吸附白百破疫苗由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)疾病預(yù)防中心提供，規(guī)格5.0 ml/支，批號(hào)：201001009-2。氫氧化鋁：沈陽市試劑三廠(批號(hào)：20080912)。(2)主要儀器：切片機(jī)型號(hào)為AO-820(美國制造)；熒光顯微鏡型號(hào)為OLYMPUS(日本制造)；照相機(jī)型號(hào)為OLYMPUS C-35AD-2(日本制造)。

1.5 造模方法[2]

乙醚麻醉大鼠，在大鼠左右前肢、后肢跖部分別注射0.1 ml、0.2 ml的抗原佐劑混懸液致敏。初次致敏5天后強(qiáng)化致敏，將0.5 mg卵自蛋白溶解于1 ml生理鹽水注入大鼠背部。初次致敏第7天開始用卵白蛋白滴鼻，1次/天，10 μl/次。連續(xù)滴鼻7天。之后隔日給予卵白蛋白1 g/L滴鼻，以維持對(duì)鼻黏膜的刺激。連續(xù)灌胃給藥4周，每隔7天觀察一次鼻部滴蛋白液30分鐘內(nèi)搔鼻次數(shù)和噴嚏次數(shù)。

1.6 癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

采取記分法記錄鼻分泌物量、噴嚏次數(shù)及鼻癢程度。方法如下：(1)鼻涕：流至前鼻孔1分；超過前鼻孔2分；涕流滿面3分。(2)噴嚏：4個(gè)以內(nèi)1分；5～10個(gè)2分；10個(gè)以上3分。(3)鼻癢：輕度抓鼻1分；頻繁抓鼻2分；抓鼻不止3分。自鼻腔激發(fā)開始觀察30分鐘，采用疊加法記分，總分超過5分為動(dòng)物造模成功[3]。

1.7 給藥方法

按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[4]人與動(dòng)物等效劑量換算方法，人與大鼠藥物每公斤體重劑量之比約為1∶6，因此各組藥物灌胃劑量如下：(1)正常對(duì)照組：按照每100 g大鼠體重予以1 ml生理鹽水灌胃；(2)模型組：同正常對(duì)照組；(3)益氣組：按每1 kg大鼠體重予以2.1 ml所試藥物煎劑(相當(dāng)于2.1 g生藥)灌胃；(4)溫陽組：按每1 kg大鼠體重予以3.6 ml所試藥物煎劑(相當(dāng)于3.6 g生藥)灌胃；(5)化飲組：按每1 kg大鼠體重予以3.2 ml所試藥物煎劑(相當(dāng)于3.2 g生藥)灌胃；(6)益氣溫陽組：按每1 kg大鼠體重予以5.7 ml所試藥物煎劑(相當(dāng)于5.7 g生藥)灌胃；(7)益氣化飲組：按每1 kg大鼠體重予以5.3 ml所試藥物煎劑(相當(dāng)于5.3 g生藥)灌胃；(8)溫陽化飲組：按每1 kg大鼠體重予以6.8 ml所試藥物煎劑(相當(dāng)于6.8 g生藥)灌胃；(9)加味小青龍湯組：按每1 kg大鼠體重予以9.0 ml所試藥物煎劑(相當(dāng)于9.0 g生藥)灌胃。各組每天一次灌胃給藥。

1.8 療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

參考1997年在?？谛抻咥R診斷標(biāo)準(zhǔn)和療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[5]，治療后癥狀累計(jì)積分減少2或3分為顯效，減少1分為有效，無變化或加重為無效。

1.9 取樣及檢測(cè)方法

將大鼠用25%烏拉坦腹腔麻醉，仰臥位固定。剪開頸部皮膚，鈍性分離，暴露頸動(dòng)脈，用一次性注射器抽取頸動(dòng)脈血3 ml，立即注入抗凝管中，靜置2小時(shí)后3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，分取血漿，-20℃保存并送檢。IL-4、TNF-α含量檢測(cè)采用ELISA法，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 給藥前后癥狀積分情況

造模后，造模各組大鼠癥狀累計(jì)積分平均達(dá)到5分以上，與正常對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明造模成功。經(jīng)過藥物治療，各藥物治療組大鼠癥狀較模型組均有所減輕，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中加味小青龍湯組明顯降低，與益氣組、溫陽組、化飲組、益氣化飲組、益氣溫陽組、溫陽化飲組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 給藥前后癥狀積分比較

注：與正常對(duì)照組比較aP<0.05，與模型組相比較bP<0.05，加味小青龍湯組與各治療組相比較cP<0.05

2.2 鼻黏膜組織病理形態(tài)學(xué)的變化

鼻黏膜組織光鏡檢查：正常對(duì)照組鼻黏膜上皮完整，無炎癥反應(yīng)(見圖1);模型組可見鼻黏膜水腫、充血，上皮不完整，重度炎細(xì)胞浸潤，嗜酸粒細(xì)胞浸潤明顯，黏膜上皮壞死(見圖2);益氣組、溫陽組、化飲組鼻黏膜有充血，中度炎細(xì)胞浸潤(見圖3、4、5);益氣溫陽組、益氣化飲組鼻黏膜有充血，少量炎細(xì)胞浸潤(見圖6、7);溫陽化飲組鼻黏膜上皮完整、黏膜少有充血，有少量炎細(xì)胞浸潤(見圖8);加味小青龍湯組鼻黏膜輕度充血，炎細(xì)胞消失(見附圖9)，尤以加味小青龍湯治療組恢復(fù)最好。

圖1 正常對(duì)照組鼻黏膜組織形態(tài)(HE染色10×40)

圖2 模型組鼻黏膜組織形態(tài)(HE染色10×40)

圖3 益氣組鼻黏膜組織形態(tài)(HE染色10×40)

圖5 化飲組鼻黏膜組織形態(tài)(HE染色10×40)

圖6 益氣溫陽組鼻黏膜組織形態(tài)(HE染色10×40)

圖7 益氣化飲組鼻黏膜組織形態(tài)(HE染色10×40)

圖8 溫陽化飲組鼻黏膜組織形態(tài)(HE染色10×40)

圖9 加味小青龍湯組鼻黏膜組織形態(tài)(HE染色10×40)

2.3 AR大鼠血漿IL-4含量測(cè)定結(jié)果

模型組IL-4含量明顯升高，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各治療組IL-4的含量降低，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，提示各給藥組均具有不同程度的降低IL-4含量的作用?；嫿M、益氣溫陽組、益氣化飲組、溫陽化飲組與益氣組、溫陽組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中以加味小青龍湯治療組效果最好，與益氣組、溫陽組、化飲組、益氣化飲組、益氣溫陽組、溫陽化飲組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，結(jié)果見表2。

表2 加味小青龍湯對(duì)AR大鼠血漿IL-4含量的影響

注：與模型組相比較aP<0.05，bP<0.01，加味小青龍湯組與各治療組相比較cP<0.05,各治療組與益氣組、溫陽組相比較dP<0.01

3 討論

加味小青龍湯治療AR臨床效驗(yàn)顯著，是在中醫(yī)基本理論指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果進(jìn)行組方的。本方是以小青龍湯、玉屏風(fēng)散合方，具有益氣溫陽化飲之功用。而AR在發(fā)作期多數(shù)體現(xiàn)出其病機(jī)特點(diǎn)為陽氣虛弱，水飲內(nèi)停[6]，故用作加味小青龍湯及其拆方的實(shí)驗(yàn)研究。

3.1 癥狀積分觀察

AR屬Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)反應(yīng)，以鼻局部的集中癥狀鼻癢、噴嚏、流涕為主要臨床表現(xiàn)，因此減輕局部癥狀是改善和調(diào)整Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的客觀依據(jù)，構(gòu)成了變態(tài)反應(yīng)性鼻炎的診斷和療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容[7]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果提示：在給藥前，各治療組和模型組癥狀積分與正常對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且總積分超過5分，表明模型制造成功。經(jīng)過治療后，各治療組噴嚏、搔鼻、流涕的積分值顯著減少，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且總積分減少2～3分，表明各治療組均能改善AR大鼠的癥狀，其中以加味小青龍湯治療組效果最顯著。

3.2 鼻黏膜病理形態(tài)的觀察

根據(jù)對(duì)大鼠AR鼻黏膜形態(tài)學(xué)的觀察，模型組可見鼻黏膜水腫、充血，上皮不完整，重度炎細(xì)胞浸潤，嗜酸粒細(xì)胞浸潤明顯，黏膜上皮壞死(見圖2)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，各治療組均不同程度的改善了鼻黏膜的病理形態(tài)，其中尤以加味小青龍湯治療組鼻黏膜病理形態(tài)恢復(fù)最好，其治療作用是通過抑制了炎癥細(xì)胞在鼻黏膜的聚集，減少了肥大細(xì)胞脫顆粒，進(jìn)一步促進(jìn)了鼻黏膜的修復(fù)，這與癥狀積分改善程度相一致，提示鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)的改變與療效相一致，因此鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)研究可用于AR療效評(píng)價(jià)。

3.3 對(duì)IL-4含量的影響

本研究通過檢測(cè)AR大鼠血漿中IL-4含量反映Th2細(xì)胞亞群的狀況，并從此角度來探討加味小青龍湯及其拆方對(duì)IL-4含量的影響。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各治療組與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示各治療組均有不同程度調(diào)節(jié)IL-4含量的作用。其中，化飲組、益氣化飲組、溫陽化飲組優(yōu)于益氣組、溫陽組，說明化飲在治療AR中具有重要作用。益氣溫陽組優(yōu)于益氣組、溫陽組，揭示二者起協(xié)同作用。加味小青龍湯組療效優(yōu)于各治療組，說明溫陽、益氣、化飲在治療AR中表現(xiàn)出協(xié)同增效的整體調(diào)節(jié)作用，體現(xiàn)了加味小青龍湯配伍的高度科學(xué)內(nèi)涵。當(dāng)然，單純依據(jù)血漿IL-4含量這一指標(biāo)，也不可能對(duì)加味小青龍湯及其拆方的作用進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，目前我們正在從免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的角度開展相關(guān)研究，有望獲得更加系統(tǒng)全面的結(jié)果，為加味小青龍湯配伍規(guī)律的研究提供新的線索。

參考文獻(xiàn)

[1] 王樹鵬, 郭曉東, 張麗艷, 等. 小青龍湯加味對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠IL-5和TNF-α含量的影響[J]. 中醫(yī)藥學(xué)刊, 2006, 24(4): 635-637.

[2] 陳忠, 唐法娣. 大鼠過敏性鼻炎模型建立及應(yīng)用[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2001, 30(6): 276-278.

[3] 張志明, 孫樹巖, 季文樾. 真菌性抗原致變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型建立[J]. 中國耳鼻咽喉頭頸外科, 2005, 12(5): 313-315.

[4] 徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社,1982:178-179.

[5] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉科學(xué)分會(huì). 變應(yīng)性鼻炎診斷標(biāo)準(zhǔn)與療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 1998, 33(3): 134-135.

[6] 王樹鵬, 劉書宇. 小青龍湯加味治療變應(yīng)性鼻炎的中醫(yī)理論探討[J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2007, 34(5): 575-576.

[7] 顧瑞金, 顧之燕. 變應(yīng)性鼻炎診斷和療評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)專題學(xué)術(shù)討論會(huì)紀(jì)要[J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 1991, 26(3): 131-133.

[8] 劉建國, 劉月輝. 變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜結(jié)構(gòu)變化及微血管重塑實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國耳鼻咽喉頭頸外科, 2010, 17(1): 15-17.