呂俊蘭 袁海龍 靳世英 付珊珊 肖小河

中藥日服用次數(shù)是中藥用法的重要內(nèi)容，直接關(guān)系臨床的安全性和有效性。目前，許多中藥在臨床上應(yīng)用時(shí)很難確切的規(guī)定服用次數(shù)，一般多憑醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)，每日服用三次較多。但是，這種服用方法是否是最科學(xué)的、最有效的，醫(yī)生不敢保證，病人同樣感到疑惑。

本課題組前期針對(duì)大黃瀉下及治療實(shí)驗(yàn)性黃疸的日服用次數(shù)做了一定的研究，發(fā)現(xiàn)在規(guī)定的劑量下，大黃以每日服用兩次為佳[1,2]。本文繼續(xù)圍繞以“效”為核心，成分藥動(dòng)學(xué)為輔佐的PD-PK研究模型為研究中心，用蒽醌類成分的整合藥代動(dòng)力學(xué)代替大黃酸的藥代動(dòng)力學(xué)，并采用血清藥理學(xué)的方法研究大黃含藥血清體外抗氧化效應(yīng)動(dòng)力學(xué)，不斷對(duì)大黃日服用次數(shù)的研究模式與方法進(jìn)行探索和創(chuàng)新，以使其早日實(shí)現(xiàn)向臨床研究和應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美國Agilent 1200型高效液相色譜儀；渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，XW-80A)；飛鴿牌離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TGL—16GB)，電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，型號(hào)：BAS124S]；酶標(biāo)儀(奧地利TECAN 公司，型號(hào)：Infnite 200)；大黃(購自甘肅省禮縣藥材公司，經(jīng)解放軍第三○二醫(yī)院肖小河研究員鑒定為掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根，批號(hào)20080425)；大黃酸，大黃素，蘆薈大黃酸，大黃素甲醚，大黃酚(標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇(色譜純，加拿大Promptar有限公司)；乙腈(分析純，北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)080611)；鹽酸(北京化工廠，批號(hào)20091010)；純凈水。

1.2 動(dòng)物與分組

SD大鼠購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-(軍)2007-004，雄性，體重(220±20)g。將大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，記為G1，G2，G3。

1.3 給藥與取血

取大黃粗粉加10倍蒸餾水浸泡30分鐘，煎煮20分鐘，趁熱濾過，殘?jiān)偌尤?0倍量的蒸餾水，煎煮20分鐘，濾過，合并濾液，減壓濃縮、干燥，粉碎為細(xì)粉，臨用前加蒸餾水溶解。G1、G2、G3組分別給予大黃提取物3.6 g/kg，1次/天(給藥時(shí)間為早上9：00)，1.8 g/kg，2次/天(給藥時(shí)間為9:00和13:00)和1.2 g/kg，3次/天(給藥時(shí)間分別為9:00、13:00和17:00)。分別于第一次給藥前(0小時(shí))及給藥后5、10、15、30分鐘，1、2、4、6、8、10、12、24小時(shí)由大鼠眼眶后靜脈取血于肝素鈉浸潤過的離心管中，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分離上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 含藥血清清除超氧陰離子自由基實(shí)驗(yàn)[3，4]

1.4.1 實(shí)驗(yàn)溶液的配制 取2.1 ml濃鹽酸，加蒸餾水定容至250 ml，得到0.1 mol/L的HCl溶液；再稱取三羥甲基氨基甲烷3.0285 g，加蒸餾水溶解，再加入114.5 ml 0.1 mol/L HCl溶液定容至500 ml，得pH=8.2的濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液；稱取鄰苯三酚1.58 g，用0.1 mol/L的HCl溶液定容至500 ml，得25 mmol/L的鄰苯三酚液。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)方法 取pH 8. 2的Tris-HCl緩沖溶液450 μl，置于 25℃水浴中預(yù)熱20分鐘，分別加入100 μl血漿樣品和30 μl 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5分鐘后，加入8 mol/L的HCl溶液100 μl終止反應(yīng)。自氧化管以100 μl蒸餾水代替樣品管中樣品，操作方法同樣品管，在325 nm處測定吸光值，以等體積pH值8.2的Tris-HCl緩沖液作為空白。計(jì)算超氧陰離子的清除率。

式中，A0為自氧化管的吸光值；A1為樣品管的吸光值。

1.5 整合藥代動(dòng)力學(xué)研究

1.5.1 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取大黃酸、大黃素甲醚、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素對(duì)照品配制成48 μg/ml、26.8 μg/ml、34 μg/ml、84 μg/ml、20 μg/ml的對(duì)照品溶液，再精密吸取上述對(duì)照品溶液配制成濃度分別為4.8 μg/ml、5.36 μg/ml、6.8 μg/ml、8.4 μg/ml及2.0 μg/ml的混標(biāo)溶液。

1.5.2 血漿樣品的處理 吸取200 μl血漿，加入8 mol/L鹽酸沉淀血漿蛋白，渦旋液體混合器上震蕩30秒后，精密加入1 ml乙醚萃取，渦旋混合2分鐘，12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離有機(jī)相，37℃水浴上氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.5.3 高效液相色譜的分析 色譜條件：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(71∶29)；柱溫：30℃；流速：1 ml/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μl。血漿樣品按1.5.2項(xiàng)下處理后的殘?jiān)?00 μl的甲醇溶解，進(jìn)樣分析，記錄五種蒽醌類成分的峰面積，以歸一化法計(jì)算相應(yīng)的血藥濃度。

1.5.4 基于曲線下面積(AUC0-∞)自定義權(quán)重系數(shù)的大黃蒽醌整合藥動(dòng)學(xué)模型的建立[5-7]根據(jù)大黃提取物給藥后測得的血藥濃度—時(shí)間數(shù)據(jù)，DAS軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，獲得大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的AUC0-∞數(shù)據(jù)，根據(jù)各成分在5種成分總AUC0-∞中所占比值自定義各成分在綜合濃度中的權(quán)重系數(shù)(ωi)，將每一時(shí)間點(diǎn)下5種單體成分的血藥濃度賦以各自的權(quán)重系數(shù)，求算大黃蒽醌的綜合濃度，進(jìn)一步進(jìn)行整合藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的研究。大黃蒽醌各成分自定義權(quán)重系數(shù)及綜合濃度的計(jì)算公式如下：

∑AUC0-∞= AUC0-∞大黃酸
+AUC0-∞蘆薈大黃素+ AUC0-∞大黃素
+ AUC0-∞大黃酚+ AUC0-∞大黃素甲醚

CT=AUC0-∞i×ωi

式中i分別代表大黃酸，蘆薈大黃素，大黃素，大黃酚，大黃素甲醚等五種蒽醌；ωi表示上述成分 AUC0-∞在5種成分總AUC0-∞中的比值；CT為自定義權(quán)重系數(shù)校正后大黃蒽醌在大鼠體內(nèi)的綜合濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)采用DAS 2.1.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，藥代動(dòng)力學(xué)采用房室模型進(jìn)行模擬；相關(guān)性分析采用SPSS 17.0中的pearson雙變量相關(guān)分析進(jìn)行，P<0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 抗氧化效應(yīng)動(dòng)力學(xué)

給予大黃提取物后不同時(shí)間點(diǎn)的含藥血清對(duì)超氧陰離子(O2·)抑制率的效應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線見圖1。給予大黃提取物后的含藥血清可明顯抑制超氧陰離子自由基，且不同G1、G2、G3之間具有顯著性差異。借鑒藥代動(dòng)力學(xué)研究中C-T曲線的解析，利用DAS.2.1.1軟件對(duì)上述E—T曲線進(jìn)行房室模型擬合和參數(shù)計(jì)算，三組的AUCE分別為649.716、1478.424、988.417，G2>G3>G1。

2.2 大黃五種蒽醌整合藥代動(dòng)力學(xué)研究

將大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚五種蒽醌的血藥濃度—時(shí)間數(shù)據(jù)利用DAS 2.1.1進(jìn)行擬合，得到各自的AUC，再采用基于曲線下面積(AUC0-∞)自定義權(quán)重系數(shù)的方法進(jìn)行大黃五種蒽醌的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行整合，整合后的藥—時(shí)曲線及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別見圖2和表1。

圖1 大黃含藥血清清除超氧陰離子的效應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

圖2 大黃蒽醌類成分的整合C-T曲線

房室參數(shù)單位參數(shù)值G1G2G3t1/2αh0．3070．91211．487t1/2βh3．4366．37311．489V1/FL·kg-11．1183．6255．828CL/FL·h-1·kg-10．5770．3940．391AUC(0-t)mg·L-1·h17．1924．18822．026AUC(0-∞)mg·L-1·h17．34525．41220．583K10h-10．5160．1090．067K12h-11．08400．007K21h-10．8570．760．06Kah-19．46216．58125．58t1/2Kah0．0730．0420．027Tlagh0．0570．0430．05

G1、G2、G3組的整合Cmax和AUC(0-t)分別為6.02、4.04、3.03和17.19、24.19、22.03，G2組Cmax雖然低于G1，但由于第四小時(shí)給與第二次藥后Cmax回升至4.31，因而在24小時(shí)內(nèi)AUC(0-t)明顯高于G1，但與G3組差別較小，其相對(duì)生物利用度為G2>G3>G1。

2.3 整合藥代動(dòng)力學(xué)與效應(yīng)動(dòng)力學(xué)的相關(guān)性研究

將三組整合后的血藥濃度數(shù)據(jù)與其相應(yīng)的效應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。G1、G2、G3組的整合血藥濃度與超氧陰離子抑制率的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.943、0.947、0.853，P值均為0.000，表明整合血藥濃度與抗氧化效應(yīng)具有顯著的相關(guān)性。

表2 整合藥代動(dòng)力學(xué)和效應(yīng)動(dòng)力學(xué)的Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

綜合效應(yīng)動(dòng)力學(xué)和整合藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，筆者認(rèn)為大黃用于抗氧化時(shí)以每天服用兩次為佳。從藥效上說，每天服用兩次清除超氧陰離子的AUCE，顯著高于給藥一次和三次組，說明每天給藥兩次時(shí)總的抗氧化效應(yīng)強(qiáng)于每天給藥一次和三次；從五種蒽醌的整合藥代動(dòng)力學(xué)上說，每天給藥兩次組的大黃蒽醌類成分經(jīng)整合后的AUC(0-t)也明顯高于每天給藥一次和三次，兩者結(jié)果一致。

現(xiàn)代對(duì)中藥的研究主要集中在藥效成分、藥理作用、作用機(jī)理等研究領(lǐng)域，這些研究雖然全面而深入，卻始終與臨床研究隔著一條不可逾越的鴻溝，不能直接為臨床服務(wù)。如今轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)已成為當(dāng)前醫(yī)藥學(xué)界迅猛發(fā)展的新興領(lǐng)域之一，它強(qiáng)調(diào)基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用之間的緊密結(jié)合，這種新的醫(yī)學(xué)研究模式倡導(dǎo)以患者為中心，從臨床工作中發(fā)現(xiàn)和提出問題，進(jìn)行深入基礎(chǔ)研究，然后再將基礎(chǔ)研究成果快速應(yīng)用于臨床，最終惠及廣大患者。中藥日服用次數(shù)與臨床聯(lián)系之緊密，使得它成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中一個(gè)十分重要且不能忽視的關(guān)鍵問題，日服用次數(shù)的研究可使基礎(chǔ)研究與臨床醫(yī)療之間建立更直接的聯(lián)系。

中醫(yī)藥的療效評(píng)價(jià)是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的前提，通過獲得療效的證據(jù)，在臨床推廣應(yīng)用，才能實(shí)現(xiàn)從醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)及政策制定的后期轉(zhuǎn)化。因此本課題組提出基于以“效”為核心、成分藥動(dòng)學(xué)為輔助(即PD-PK)模型的中藥日服用次數(shù)研究方法[8，9]，更加貼近臨床，彌補(bǔ)了“唯成分論”的不足，適宜于中藥日服次數(shù)的研究。本文對(duì)前期建立的中藥日服用次數(shù)的研究方法和模式進(jìn)行了不斷的探索與創(chuàng)新，尤其是多效應(yīng)成分的整合藥代動(dòng)學(xué)以及血清藥理學(xué)方法的提出和應(yīng)用，為多組分中藥及中藥復(fù)方的研究提供了可靠的基礎(chǔ)。中藥日服用次數(shù)可迅速實(shí)現(xiàn)基礎(chǔ)研究到臨床研究及應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，這不僅遵守了“源于臨床，證于實(shí)驗(yàn)，回歸臨床”的研究思路，更為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供了新的研究手段。

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