張 旭 劉正娟 翟 娜 吳 鳴 滕懿群 陳俊國(guó) 駱秋龍 陸 燕

肥胖癥是糖尿病、高血壓、冠心病等疾病的主要危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅人類健康。瘦素抵抗是肥胖癥發(fā)病的機(jī)制之一［1］。SOCS3(suppressors of cytokine signaling 3)基因的過度表達(dá)可導(dǎo)致瘦素抵抗，在肥胖癥的發(fā)病過程中起重要作用［2～4］。本實(shí)驗(yàn)觀察抑制SOCS3基因表達(dá)對(duì)高脂肥胖大鼠瘦素抵抗的影響。

材料與方法

1.主要材料:LV-shSOCS3，LV-negtive，病毒效價(jià)為1.0×1010TU/L，由本課題組前期構(gòu)建。SD大鼠60只健康，雄性，5周齡體重100～130g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。ABI7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司);大鼠中樞立體定位儀(成都泰盟科技有限公司);Trizol試劑(Invitrogen公司)。瘦素放射免疫試劑盒(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心)。

2.方法:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:選用5周齡的健康雄性SD大鼠60只，體重100～130g，隨機(jī)分為3組，每組20只:①實(shí)驗(yàn)組:下丘腦注射LV-shSOCS3，高脂飼料喂養(yǎng);②陰性組:下丘腦注射LV-negtive，高脂飼料喂養(yǎng);③對(duì)照組:下丘腦注射生理鹽水，高脂飼料喂養(yǎng)。(2)動(dòng)物模型的制作:大鼠禁食12h后用10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，固定于中樞立體定位儀上。頭部去除毛發(fā)，消毒，沿中線做1.5cm的切口，暴露顱骨，刮凈骨膜，顯露前囟，按照SD大鼠腦立體定位圖譜，于前囟后2.8mm，矢狀縫右側(cè)0.4mm處用骨鉆鉆一直徑約1mm的骨孔，以小號(hào)針頭刺破硬腦膜，5μl微量注射器針頭垂直插入顱骨表面下9.5mm(下丘腦弓狀核處)注射2μl LV-shSOCS3(或 LV-negtive或生理鹽水)，速度0.4μl/min，注射完畢后休息5min，以1mm/min的速度退針。手術(shù)后縫合傷口，局部抗感染。所有動(dòng)物均兩只一籠喂養(yǎng)，予以高脂飼料(脂肪66%，糖類25%，蛋白質(zhì)9%)，共喂養(yǎng)8周，期間自由飲水，不限飼料量，每周稱重1次。其間有部分大鼠因打藥不慎死亡，數(shù)據(jù)剔除。(3)標(biāo)本收集與保存:大鼠喂養(yǎng)8周末，自由飲水，禁食12h后用10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔內(nèi)注射，麻醉成功后開胸心臟取血約5ml，3000r/min離心10min，分離血清待檢，同時(shí)迅速取出下丘腦，取一小塊行冷凍切片，在熒光顯微鏡下觀察注射位置是否在下丘腦，其余部分置于液氮中保存。(4)血脂和瘦素檢測(cè):血標(biāo)本全部采集后，采用酶顯色法檢測(cè)血脂(血總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇)濃度。利用放射免疫法檢測(cè)血清瘦素水平。(5)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)下丘腦內(nèi)瘦素受體(OBRb)﹑SOCS3mRNA表達(dá)水平的測(cè)定:用Trizol提取下丘腦組織總RNA。以等量RNA為起始模板，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。SOCS3上、下游引物:5'-ACCAGCGCCACTTCT TCACG-3'，5'-GTGGAGCATCATACTGATCC-3'，OB-Rb 上、下游引物:5'-AGAATTGTTCCTGGGCACAAG-3'，5'-ACACTCATCCTCACAGGTTCC-3'，內(nèi)參 β-actin上、下游引物5'-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3'，5'-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3'。在ABI7500全自動(dòng)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件 SOCS3為 95℃ 預(yù)變性 5min;95℃ 10s;57℃ 15s，72℃20s，共35個(gè)循環(huán)。OB-Rb為94℃預(yù)變性3min;94℃ 30s;57℃ 30s;72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)。

結(jié) 果

1.下丘腦注射慢病毒結(jié)果:高脂喂養(yǎng)8周后，剔除因下丘腦注射不慎死亡的大鼠，成模大鼠45只。熒光顯微鏡下觀察到所有被注射LV-shSOCS3和LV-negtive大鼠的下丘腦均有綠色熒光蛋白表達(dá)，說明注射位置正確;注射生理鹽水的大鼠下丘腦未見有熒光蛋白表達(dá)。

2.經(jīng)RNA干擾后大鼠體重的變化:注射前，各組大鼠體重?zé)o明顯差異。注射后予以高脂飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組體重增長(zhǎng)低于其他兩組，喂養(yǎng)8周末，實(shí)驗(yàn)組平均體重明顯低于其他兩組(P＜0.05)，而陰性組和對(duì)照組之間無明顯差異(P＞0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠體重比較( ± s，n=15)

表1 各組大鼠體重比較( ± s，n=15)

與對(duì)照組比較，aP ＜0.05，cP ＞0.05，dP＞0.05;與陰性組比較，bP ＜0.05，eP＞0.05

組別 0周 2周 4周 6周 8周對(duì)照組 111.33±9.50 224.46±18.92 323.93±22.97 400.60±23.99 450.87±23.83陰性組 112.93±9.87c 221.80±22.06c 316.07±22.60c 395.67±21.98c 443.80±15.79實(shí)驗(yàn)組 109.33±10.70de 186.66±22.59ab 251.27±25.94ab 295.60±27.09ab 337.40±28.83ab

3.血清瘦素、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的變化:實(shí)驗(yàn)組瘦素，TG、TC、LDL-C 均明顯低于其他兩組(P＜0.05)，對(duì)照組和陰性組之間無明顯差異(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)組HDL-C明顯高于其他兩組(P＜0.05)，對(duì)照組和陰性組之間無顯著差異(P ＞0.05)，詳見表2。

表2 各組大鼠瘦素和血脂的比較( ± s，n=15)

表2 各組大鼠瘦素和血脂的比較( ± s，n=15)

與對(duì)照組比較，aP＜0.05，cP＞0.05;與陰性組比較，bP＜0.05

組別 瘦素(ng/ml) TG(mmol/L) TC(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L)對(duì)照組 1.22±0.30 0.64±0.17 1.39±0.25 1.27±0.16 0.77±0.12陰性組 1.11±0.13c 0.65±0.27c 1.42±0.28c 1.29±0.19c 0.75±0.16c實(shí)驗(yàn)組 0.63±0.11ab 0.38±0.16ab 1.14±0.31ab 1.77±0.26ab 0.57±0.09ab

4.大鼠下丘腦SOCS3、OB-Rb基因表達(dá)的變化:實(shí)驗(yàn)組SOCS3 mRNA明顯低于其他兩組(P＜0.05)，對(duì)照組和陰性組之間無顯著差異(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)組OB-Rb mRNA明顯高于其他兩組 (P＜0.05)，對(duì)照組和陰性組之間無顯著差異(P＞0.05)，詳見表3。

表3 各組大鼠下丘腦SOCS3、OB-Rb基因表達(dá)的比較( ± s，n=15)

表3 各組大鼠下丘腦SOCS3、OB-Rb基因表達(dá)的比較( ± s，n=15)

與對(duì)照組比較，aP＜0.05，cP＞0.05;與陰性組比較，bP＜0.05

組別SOCS3 mRNA OB-Rb mRNA對(duì)照組1.43±0.30 0.51±0.20陰性組 1.35±0.25c 0.59±0.27c實(shí)驗(yàn)組 0.34±0.19ab 1.34±0.39ab

討 論

肥胖癥是由于長(zhǎng)期能量攝入超過人體消耗，使體內(nèi)脂肪增多，體重超過一定范圍的一種營(yíng)養(yǎng)障礙性疾病。隨著肥胖發(fā)生率逐年遞增，由肥胖所帶來的種種并發(fā)癥如糖尿病、心腦血管疾病等嚴(yán)重危害人類的健康。瘦素是肥胖基因表達(dá)產(chǎn)物，具有抑制食欲，減少食物攝入，增加能量消耗的作用，使機(jī)體不至于過度肥胖［5，6］。研究表明肥胖者血清瘦素并不降低反而表現(xiàn)為高瘦素血癥，提示肥胖者存在瘦素抵抗。多種原因均可引起瘦素抵抗，而向飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠中樞注射瘦素并無療效，說明瘦素抵抗發(fā)生在受體及受體后轉(zhuǎn)導(dǎo)水平［7］。肥胖者OB-Rb的mRNA表達(dá)下調(diào)參與瘦素抵抗的發(fā)生機(jī)制［8］。SOCS3是由細(xì)胞因子和一些激素誘導(dǎo)的SOCS蛋白質(zhì)家族的一個(gè)成員，它主要通過抑制細(xì)胞因子或激素與其受體結(jié)合后胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而減弱細(xì)胞因子或激素的生理作用［9］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明高脂誘導(dǎo)的肥胖鼠下丘腦和白色脂肪組織中SOCS3基因表達(dá)明顯增加并參與瘦素抵抗的發(fā)生，進(jìn)而參與了多種疾病的形成過程，因此可以推測(cè)通過下調(diào)體內(nèi)SOCS3基因的表達(dá)來減弱其抑制相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，在疾病治療中具有一定的應(yīng)用前景。RNA干擾技術(shù)作為新興的基因沉默技術(shù)具有明顯優(yōu)勢(shì)，它比反義核酸技術(shù)有效，比基因敲除技術(shù)簡(jiǎn)單，具有基因沉默高度特異性及高效性的優(yōu)點(diǎn)。目前，RNA干擾技術(shù)已基本成熟，已被廣泛應(yīng)用于許多疾病的治療研究中［10，11］。

本研究將SOCS3 RNAi慢病毒液注射到大鼠下丘腦后，實(shí)驗(yàn)組下丘腦的SOCS3mRNA表達(dá)水平明顯下降。在高脂喂養(yǎng)8周后，該組大鼠體重、血清瘦素、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇較其他兩組下降明顯，而高密度脂蛋白膽固醇則升高，同時(shí)該組大鼠下丘腦OB-Rb的mRNA水平明顯高于其他兩組，提示下調(diào)SOCS3基因后可緩解大鼠的高脂性肥胖及瘦素抵抗的程度。大鼠下丘腦注射慢病毒干擾液后，慢病毒載體進(jìn)入下丘腦神經(jīng)細(xì)胞，能將攜帶的目的基因整合到細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)RNA干擾，此時(shí)予以大鼠高脂喂養(yǎng)8周，由于慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾可長(zhǎng)期、穩(wěn)定、高效地下調(diào)目的基因，那么高脂喂養(yǎng)大鼠本該上調(diào)的SOCS3基因可被長(zhǎng)期沉默。通過RNAi下調(diào)SOCS3基因后，SOCS3抑制瘦素與OBRb結(jié)合后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用減弱，使瘦素能正常的發(fā)揮其降脂作用，使高脂喂養(yǎng)的大鼠脂肪含量減少，體重下降。大鼠體重的下降，一方面，抑制脂肪刺激瘦素的分泌;另一方面，促進(jìn)OB-Rb基因的表達(dá);進(jìn)而改善了肥胖大鼠的瘦素抵抗。

本研究在動(dòng)物模型水平證實(shí)了抑制下丘腦SOCS3基因?qū)Ψ逝执笫笫菟氐挚购头逝殖潭鹊母纳谱饔?，為進(jìn)一步研究人類瘦素抵抗和肥胖癥的發(fā)生機(jī)制提供了極為有利的工具。

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