林 志 呂建軍 屈 哲 李珊珊 張 迪 楊艷偉 李 波

單克隆抗體類藥物作為一種新型的生物技術(shù)藥物具有特定的免疫性。如果除了與適應(yīng)證相關(guān)本身特定的靶器官外，人體正常組織細(xì)胞中存在相同或相似的抗原決定簇，單克隆抗體類藥物則可能會與非靶器官外的其他組織或細(xì)胞結(jié)合，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)［1］。因此單克隆抗體類藥物的免疫交叉反應(yīng)在藥物臨床前的安全性評價中非常重要。根據(jù)FDA的相關(guān)規(guī)定，抗體類藥物的免疫交叉反應(yīng)常常采用正常成人組織或相應(yīng)的細(xì)胞株進(jìn)行免疫組織化學(xué)或免疫細(xì)胞化學(xué)試驗［2］。然而，單克隆抗體藥物作為一種創(chuàng)新的生物技術(shù)藥物，尤其是全人源化單抗藥物的研發(fā)，其人體組織交叉反應(yīng)在技術(shù)上仍存在很多困難，如何采用合適的免疫組織化學(xué)的方法是我們需要深入討論的問題［3］。本文擬通過兩種不同的單克隆抗體藥物進(jìn)行組織交叉反應(yīng)的比較研究，以探討免疫組織化學(xué)常規(guī)二步法和直接法在人體組織交叉反應(yīng)研究中的應(yīng)用。

材料與方法

1.單克隆抗體的準(zhǔn)備:實驗采用了兩種不同的單克隆抗體藥物，分別為貝伐單抗(抗血管內(nèi)皮生長因子受體單克隆抗體)和美羅華(抗CD20單克隆抗體，羅氏公司)。其中貝伐單抗為全人源化單克隆抗體，美羅華為人鼠嵌合型單克隆抗體。根據(jù)各抗體的預(yù)實驗結(jié)果，采用不同的抗體最佳濃度進(jìn)行多種免疫組織化學(xué)方法的比較研究(表1)。

表1 不同免疫組織化學(xué)方法中兩種抗體的最佳濃度*

2.正常人體組織以及腫瘤組織的準(zhǔn)備:貝伐單抗是抗血管內(nèi)皮生長因子受體單克隆抗體(VEGF)，因此相應(yīng)選用高表達(dá)VEGF的人血管肉瘤組織(由南京醫(yī)科大學(xué)提供)作為實驗對象。美羅華是抗B淋巴細(xì)胞表面抗原CD20的單克隆抗體，因此相應(yīng)選用人淋巴結(jié)(由中國食品藥品檢定研究院提供)作為實驗對象。上述組織通過相關(guān)抗體證實其對應(yīng)抗原均保存良好。

3.免疫組織化學(xué)方法:(1)常規(guī)二步法:正常人體組織或腫瘤組織組織切片脫蠟水化;3%H2O2作用10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;蒸餾水洗，PBS浸泡5min;微波抗原修復(fù)10min;蒸餾水及PBS漂洗;正常羊血清工作液封閉，放置37℃溫箱孵育60min;滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜;PBS漂洗;滴加二抗(貝伐單抗為全人源化單抗，對應(yīng)二抗為羊抗人多克隆抗體，北京中杉金橋有限公司提供;美羅華為人鼠嵌合型單抗，對應(yīng)二抗為羊抗鼠F(ab)多克隆抗體，PIERCE公司提供)，37℃溫箱孵育60min;貝伐單抗采用DAB溶液顯色，美羅華采用堿性磷酸酶顯色;脫水透明后封片。(2)直接法:正常人體組織或腫瘤組織組織切片脫蠟水化;3%H2O2作用10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;蒸餾水洗，PBS浸泡5min;微波抗原修復(fù)10min;蒸餾水及PBS漂洗;正常羊血清工作液封閉，放置37℃溫箱孵育60min;內(nèi)源性生物素封閉;滴加生物素標(biāo)記的一抗，4℃冰箱孵育過夜;PBS漂洗;滴加鏈酶卵白素(streptavidin-HRP)，37℃溫箱孵育60min;DAB溶液顯色;蘇木精復(fù)染，自來水洗，鹽酸乙醇分化，返藍(lán);脫水透明后封片。

4.免疫組織化學(xué)方法評分:貝伐單抗以腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號，美羅華以淋巴結(jié)B淋巴細(xì)胞胞膜出現(xiàn)藍(lán)色顆粒為陽性信號。按Breasalier等［4］的方法判斷染色結(jié)果。在每張切片隨機(jī)選取10個視野，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級，并分別記分，陰性:細(xì)胞無著色(0分)，弱陽性:淺黃色或淺藍(lán)色(1分)，中度陽性:棕黃色或藍(lán)色(2分)，強(qiáng)陽性:深棕黃色或深藍(lán)色(3分)。計算每一染色強(qiáng)度的細(xì)胞占視野的百分?jǐn)?shù)，根據(jù)下列公式計算平均染色強(qiáng)度(insensity score)，IS=∑{〔0×F0〕+〔1×F1〕+〔2×F2〕+〔3×F3〕}，式中，F(xiàn)=每一強(qiáng)度細(xì)胞所占視野百分?jǐn)?shù)×10視野。

5.統(tǒng)計學(xué)方法:所有實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.貝伐單抗不同免疫組織化學(xué)方法的結(jié)果:采用直接法進(jìn)行貝伐單抗的組織交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性對照組背景干凈，血管肉瘤未著色，為陰性表達(dá)(圖1A)。實驗組采用生物素標(biāo)記后的20μg/ml貝伐單抗，血管肉瘤組織呈深棕黃色，為強(qiáng)陽性表達(dá)(圖1B)。采用常規(guī)免疫組織化學(xué)二步法進(jìn)行貝伐單抗的組織交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性對照組血管肉瘤組織中淋巴細(xì)胞及纖維組織呈淺黃色，為弱陽性表達(dá)，腫瘤細(xì)胞未著色(圖1C)。實驗組采用200μg/ml貝伐單抗，血管肉瘤組織呈淺黃色，為弱陽性表達(dá)(圖1D)。如圖所示直接法可以有效地減低背景的非特異性染色，并且提高實驗的靈敏度，僅在20μg/ml就顯示出較好的染色結(jié)果。比較兩種方法，直接法中實驗組血管肉瘤組織的平均染色強(qiáng)度與陰性對照組存在顯著性差異(P＜0.01)，而常規(guī)二步法中實驗組血管肉瘤組織的平均染色強(qiáng)度與陰性對照組差異不明顯(圖2)。

圖1 貝伐單抗組織交叉反應(yīng)不同方法的比較(×200)

圖2 貝伐單抗的組間平均染色強(qiáng)度差異性比較

2.美羅華不同免疫組織化學(xué)方法的結(jié)果:美羅華為抗CD20單克隆抗體，因此該抗體能與淋巴濾泡中的B細(xì)胞結(jié)合。采用直接法進(jìn)行美羅華的組織交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性對照組背景干凈，淋巴結(jié)濾泡(B細(xì)胞)及髓竇內(nèi)未著色，為陰性表達(dá)(圖3A和圖3C)。實驗組采用生物素標(biāo)記后的100μg/ml美羅華，僅在淋巴結(jié)髓竇內(nèi)見巨噬細(xì)胞呈深棕黃色，為強(qiáng)陽性表達(dá)(圖3D)。采用常規(guī)免疫組織化學(xué)二步法進(jìn)行美羅華的組織交叉反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性對照組淋巴結(jié)未著色(圖3E)。實驗組采用20μg/ml美羅華，淋巴結(jié)濾泡(B細(xì)胞)呈藍(lán)色，為陽性表達(dá)(圖3F)。如圖3所示，直接法未能有效地顯示美羅華與B細(xì)胞的結(jié)合，反而出現(xiàn)了髓竇巨噬細(xì)胞非特異性染色。常規(guī)二步法美羅華僅在20μg/ml就顯示出特異性的染色結(jié)果，淋巴濾泡B細(xì)胞呈藍(lán)色，為陽性表達(dá)。

討 論

1975年Kohler和Milstein創(chuàng)立了雜交瘤技術(shù)，為單克隆抗體的研制和開發(fā)揭開了序幕。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日臻完善，完全人源化抗體已經(jīng)實現(xiàn)，即通過滅活小鼠內(nèi)源性免疫球蛋白基因，再將人免疫球蛋白基因嵌于其基因組后產(chǎn)生［5］。由于該類生物技術(shù)藥物在疾病治療中廣闊的應(yīng)用前景，單克隆抗體藥物成為了各國科學(xué)家研究的重要領(lǐng)域［6，7］。

圖3 美羅華組織交叉反應(yīng)不同方法的比較(×200)

如果人體正常組織細(xì)胞中存在相同或相似的抗原決定簇，單克隆抗體類藥物則可能會與非靶器官外的其他組織或細(xì)胞結(jié)合，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此單克隆抗體類藥物的組織交叉反應(yīng)在藥物臨床前的安全性評價中非常重要［8］。免疫組織化學(xué)在很多技術(shù)上存在困難［9，10］。尤其是最近以來，完全人源化單克隆抗體藥物的研發(fā)成為熱點，這使得人源化單抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究中所選用的二抗為羊抗人抗體。因此，正常人組織能與二抗(抗人組織抗體)結(jié)合造成背景非特異性染色增強(qiáng)，很大程度上干擾了實驗結(jié)果。盡管有部分文獻(xiàn)提供了一些解決辦法，如采用與待測組織相同的5%的正常血清(人血清)稀釋二抗;采用經(jīng)胃蛋白酶消化處理二抗使其不含F(xiàn)c段;采用二抗相同種族的正常血清封閉切片等［11，12］。但是這只能部分解決非特異性染色的問題，目前仍沒有可接受的辦法。

本文通過兩種不同類型的單克隆抗體藥物貝伐單抗和美羅華，分別采用了常規(guī)二步法和直接法，進(jìn)行了人體組織交叉反應(yīng)。實驗結(jié)果表明貝伐單抗采用直接法，能夠有效地顯示出與血管肉瘤組織的結(jié)合，其特異性及敏感性都遠(yuǎn)高于常規(guī)二步法。直接法采用生物素化的抗體，避免了抗人二抗的使用，減少了二抗與人體組織的非特異性結(jié)合。此外，通過鏈酶卵白素放大系統(tǒng)，放大了抗體與組織結(jié)合的效力。然而，美羅華實驗卻反應(yīng)出相反的結(jié)果。生物素直接標(biāo)記的美羅華與淋巴結(jié)B細(xì)胞未見結(jié)合，反而在髓竇內(nèi)巨噬細(xì)胞出現(xiàn)非特異性的結(jié)合。采用常規(guī)二步法，美羅華與淋巴結(jié)B細(xì)胞出現(xiàn)特異性結(jié)合，并且由于美羅華是人鼠嵌合型單抗，二抗采用抗鼠的二抗，有效地減低了背景性的染色。

直接法與常規(guī)二步法對于單抗藥物的組織交叉反應(yīng)各有利弊。直接法的優(yōu)勢在于其能有效地避免抗人抗體作為二抗的使用，從而降低了背景染色，有利于最終結(jié)果的判定。然而，生物素直接標(biāo)記后無法確定是否改變了受檢單抗的結(jié)構(gòu)特征，因而修飾過的抗體可能與其他非特異性抗原結(jié)合，提高實驗的假陽性。常規(guī)二步法的優(yōu)點在于直接受檢的單抗為一抗，因此抗體的特征與最終臨床使用的抗體藥物一致，結(jié)果最為真實地反映了藥物與靶位抗原的結(jié)合情況。但是，隨著全人源化單抗的日益增多，在常規(guī)二步法中需要應(yīng)用抗人抗體作為二抗，這屆不可避免的造成二抗直接與人體組織標(biāo)本的非特異性抗原結(jié)合，從而使得背景染色增強(qiáng)，干擾了最終結(jié)果的判定。

本文通過不同實驗方法的比較，采用兩種不同的單抗，發(fā)現(xiàn)不同的單抗適用不同的試驗方法。一般而言，以下循序適用于初次研究者進(jìn)行人體組織交叉反應(yīng)研究，即先采用常規(guī)二步法，如果背景染色過強(qiáng)時考慮換用直接法。最終試驗方法的確定取決于該單抗的組織交叉反應(yīng)結(jié)果。有文獻(xiàn)報道，常規(guī)二抗法中二抗的選擇非常重要，避免選用Fc段的二抗可以在一定程度上改善結(jié)果［13～15］。當(dāng)檢測抗體為全人源化抗體時，可以采用抗獨(dú)特型抗體作為二抗進(jìn)行組織交叉反應(yīng)。但是仍需要注意抗獨(dú)特型抗體是否結(jié)合內(nèi)源性的IgG，并確定其不會改變測試抗體的親和力。在采用生物素標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時有兩個問題需要考慮:第一是必須對陰性對照抗體同時進(jìn)行生物素標(biāo)記，第二必須在加一抗前阻斷內(nèi)源性的生物素。通常阻斷采用卵白素和生物素，并且需要采用去除一抗的染色以平行比較內(nèi)源性生物素結(jié)合的情況。總之，組織交叉反應(yīng)作為單克隆藥物的臨床前安全性評價的重要組成部分，只有提高是建立和完善該類創(chuàng)新生物技術(shù)藥物的臨床前安全性評價體系的基礎(chǔ)，才能促進(jìn)我國生物技術(shù)藥物的蓬勃發(fā)展。

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6 姜倩倩，劉京貞，蘇瑞強(qiáng).單克隆抗體藥物進(jìn)展［J］.藥物生物技術(shù)，2005，12(4):270-274

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