史 強(qiáng) 魏英杰 崔傳玨 李 君 劉曉艷 白媛媛

未發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中，其增殖受到細(xì)胞之間接觸程度的調(diào)節(jié)和影響，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一個(gè)臨界點(diǎn)，細(xì)胞之間相互匯合接觸，形成完全融合的單層細(xì)胞層時(shí)，細(xì)胞增殖能力喪失，生長(zhǎng)停滯，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為接觸抑制。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)基因22(TGF-β stimulated clone-22，TSC-22)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)在多種心臟病模型中表達(dá)明顯升高的基因，可能在心臟重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年有文獻(xiàn)報(bào)道，在發(fā)生了接觸抑制的NIH3T3細(xì)胞系中TSC-22表達(dá)顯著升高，提示其可能參與調(diào)控該細(xì)胞系接觸抑制發(fā)生后的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程［1］。而在心臟成纖維細(xì)胞中，接觸抑制對(duì)TSC-22的表達(dá)有何影響，迄今尚未見(jiàn)諸報(bào)道。

材料與方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)和分組:選用新生1～3天SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠，無(wú)菌條件下開(kāi)胸取其心臟，用眼科剪剪成均勻的組織塊，37℃水浴條件下用0.08%胰蛋白酶反復(fù)消化數(shù)次至組織塊完全消化，收集消化液，離心棄上清，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，接種于T25培養(yǎng)瓶中。采用差速貼壁法獲得心臟成纖維細(xì)胞，分離得到的成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第2代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后，無(wú)血清處理24h，胰酶消化混懸后，以下述不同的濃度接種并分組，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn):(1)以不同初始密度接種細(xì)胞，分為兩組:①50%融合組:以 1.0×105/ml密度接種細(xì)胞于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h;②100%融合組:以2.0×105/ml密度接種細(xì)胞于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h。(2)均以2.0×105/ml的初始密度接種細(xì)胞于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分為4組:①未融合組:接種后培養(yǎng)6h(至貼壁未融合狀態(tài));②融合組:接種后培養(yǎng)24h(至100%融合狀態(tài));③胰酶消化打破融合組:接種后培養(yǎng)至100%融合后，0.25%胰酶消化，離心混懸后重新貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)6h(此時(shí)細(xì)胞重新貼壁但未融合);④胰酶消化重新達(dá)融合組:接種后培養(yǎng)至100%融合后，0.25%胰酶消化，離心混懸后重新貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)24h，(此時(shí)細(xì)胞重新達(dá)到100%融合)。

2.RNA提取real-time PCR(RT-PCR)檢測(cè):按照Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)說(shuō)明書(shū)所提供的方法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Real-time PCR反應(yīng)采用GAPDH作為內(nèi)參，TSC-22及GAPDH引物合成由大連寶生物公司完成，序列分別為:5'-TSC-22 CGAGTCGGATTGAGCTGCTG-3'(上游)，5'-GCAGCCTGGTTCAAACTAGATAAAG-3'(下游);5'-GAPDH GGCACATCAAGGCTGAGAATG-3'(上游)，5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'(下游);反應(yīng)體系 10μl:cDNA4μl，上下游引物各 1μl，Power SYBR Green PCR Master Mix(美國(guó) ABI公司)4μl。使用Applied Biosystems 7300實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀檢測(cè)，數(shù)據(jù)處理采用2-△△CT法。

3.蛋白提取及Western blotting檢測(cè):胰酶消化法收集各組細(xì)胞，棄上清，PBS洗3遍，加入細(xì)胞裂解液后，于4℃裂解20min，12000r/min，4℃離心后，收集上清，BCA法測(cè)定提取液的總蛋白濃度。50 μg蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，洗膜后加一抗:抗TSC-22抗體(美國(guó) Novus公司)，稀釋度為1∶500，或抗β-tubulin抗體，稀釋度為 1∶3000，4℃ 孵育過(guò)夜，洗膜，加HRP標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫孵育1h，洗膜，ECL法顯色。用Quantity One軟件(美國(guó)Bio Rad公司)掃描條帶并分析灰度值。

結(jié) 果

細(xì)胞接種培養(yǎng)一定時(shí)間后，隨著細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)，細(xì)胞之間互相緊密接觸，形成完全融合的單層細(xì)胞層，鏡下觀察培養(yǎng)瓶底部平面全部被細(xì)胞所覆蓋，即為達(dá)到100%融合，見(jiàn)圖1。以不同密度接種細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，100%融合組與50%融合組相比，TSC-22 mRNA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖 2。

如圖3所示，以不同密度接種細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，100%融合組與50%融合組相比，TSC-22蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 以不同密度接種細(xì)胞，達(dá)到不同融合度后，TSC-22的蛋白表達(dá)水平

如圖4所示，以同一密度接種細(xì)胞，培養(yǎng)24h達(dá)到100%融合后，與培養(yǎng)6h貼壁未融合組相比，TSC-22 mRNA水平顯著升高;胰酶消化打破融合，培養(yǎng)6h后，與培養(yǎng)24h達(dá)到100%融合組相比，TSC-22 mRNA水平顯著下降;胰酶消化后培養(yǎng)24h，重新達(dá)到100%融合后，與胰酶消化后培養(yǎng)6h貼壁未融合組相比，TSC-22 mRNA水平顯著升高。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 以相同密度接種細(xì)胞，達(dá)到不同融合度及經(jīng)胰酶消化處理后，TSC-22的mRNA表達(dá)水平

如圖5所示，以同一密度接種細(xì)胞，培養(yǎng)24h達(dá)到100%融合后，與培養(yǎng)6h貼壁未融合組相比，TSC-22蛋白水平顯著升高;胰酶消化打破融合，培養(yǎng)6h后，與培養(yǎng)24h達(dá)到100%融合組相比，TSC-22蛋白水平顯著下降;胰酶消化后培養(yǎng)24h，重新達(dá)到100%融合后，與胰酶消化后培養(yǎng)6h貼壁未融合組相比，TSC-22蛋白水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

討 論

TSC-22是最早由 Shibanuma等［2］于1992年在小鼠成骨細(xì)胞MC3T3E1中鑒定的，受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導(dǎo)高表達(dá)的基因。TSC-22基因在物種間高度保守，屬于TSC-22/DIP/Bun轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族蛋白分子內(nèi)均含有一段亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)［3，4］。已有文獻(xiàn)報(bào)道TSC-22在多種心臟病模型中表達(dá)明顯升高，提示其可能參與心臟病理性重構(gòu)過(guò)程，但調(diào)控其表達(dá)的機(jī)制及具體的生物學(xué)功能尚不明確。Stanton等［5］對(duì)大鼠心肌梗死模型心臟左室及室間隔心臟組織中表達(dá)發(fā)生變化的基因進(jìn)行芯片篩選，發(fā)現(xiàn)心臟左室及室間隔組織中TSC-22 mRNA水平在心肌梗死后2～16周均顯著升高，提示其參與心肌梗死后的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程。Rysa等［6］對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚到心力衰竭過(guò)程中表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行芯片篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心力衰竭心臟的左室心肌組織中TSC-22轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，提示其參與了心臟重構(gòu)過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Chen等［7］對(duì)快速起搏誘導(dǎo)的豬心房纖顫模型的心耳組織中表達(dá)發(fā)生變化的基因進(jìn)行芯片篩選，亦發(fā)現(xiàn)TSC-22 mRNA水平的升高，同時(shí)伴隨轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βmRNA表達(dá)的上調(diào)，提示TSC-22可能在心房纖顫伴隨的心肌纖維化及成纖維細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

Kuppers等［1］報(bào)道，在發(fā)生了接觸抑制 的NIH3T3細(xì)胞系中TSC-22 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高。本研究組之前的結(jié)果表明，在大鼠心肌梗死心臟組織中，TSC-22蛋白水平在發(fā)生心肌梗死1天～2周時(shí)與假手術(shù)對(duì)照組相比均呈升高趨勢(shì)［8］。在心肌梗死后的這一時(shí)相中，心梗部位的心臟成纖維細(xì)胞大量增殖，并在過(guò)度增殖的部位存在一定程度的接觸抑制現(xiàn)象，在這些部位發(fā)生的接觸抑制可能是導(dǎo)致TSC-22表達(dá)上調(diào)的重要原因［9，10］。本研究中，我們通過(guò)以不同的密度接種心臟成纖維細(xì)胞，檢測(cè)接觸抑制對(duì)TSC-22表達(dá)的影響，結(jié)果表明，以不同密度接種心臟成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間，高密度組細(xì)胞達(dá)到完全融合后，TSC-22的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較低密度未完全融合組細(xì)胞中顯著升高。另外，以相同密度接種心臟成纖維細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)達(dá)到完全融合后，TSC-22的mRNA和蛋白表達(dá)水平均較未達(dá)到完全融合的組別顯著升高，進(jìn)一步地，用胰酶打破完全融合細(xì)胞組的接觸后，TSC-22的mRNA和蛋白表達(dá)水平較完全融合細(xì)胞組顯著下降，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，當(dāng)打破融合的細(xì)胞組重新達(dá)到完全融合后，TSC-22的mRNA和蛋白表達(dá)水平較融合打破組又顯著升高。這些結(jié)果均明確表明，接觸抑制是調(diào)控TSC-22的重要因素。

已有研究結(jié)果顯示，TSC-22在某些種類(lèi)的癌細(xì)胞系中具有調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生等生物學(xué)功能［3，11，12］。接觸抑制是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的一個(gè)重要的生物學(xué)機(jī)制，目前的研究觀點(diǎn)認(rèn)為，未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞達(dá)到完全融合后的接觸抑制現(xiàn)象是一個(gè)主動(dòng)有序發(fā)生的生物學(xué)過(guò)程，在該過(guò)程中，一系列與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化，形成一個(gè)級(jí)聯(lián)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)［1］。本研究發(fā)現(xiàn)，TSC-22是心臟成纖維細(xì)胞接觸抑制發(fā)生時(shí)表達(dá)明確上調(diào)的一個(gè)新基因，這提示在心臟成纖維細(xì)胞在接觸抑制發(fā)生時(shí)，TSC-22可能通過(guò)行使其作為轉(zhuǎn)錄因子的特定功能，在接觸抑制所觸發(fā)的信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。對(duì)TSC-22確切生物學(xué)功能及其作用機(jī)制的深入研究，將有助于對(duì)心臟重構(gòu)機(jī)制的進(jìn)一步理解和闡明，并可能作為一個(gè)新的生物標(biāo)志物或治療靶標(biāo)應(yīng)用于心臟病的臨床診斷及治療。

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