張艷君 程謨斌 代 輝 沈珝琲 張 業(yè)

p53蛋白作為一個重要的轉錄因子，可以調控多種基因的表達，它也是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子之一［1］。有研究表明，在大約50%人類癌癥中，p53基因發(fā)生了突變。p53作為一個轉錄因子，當細胞處于應激狀態(tài)時，會以四聚體的形式緊密結合DNA，通過激活一系列下游靶基因，發(fā)揮其調控DNA修復、調節(jié)細胞周期和細胞凋亡的功能［2，3］。很多研究顯示p53蛋白的激活是一個多級多因子參與的復雜調控機制，這其中p53的翻譯后修飾發(fā)揮著至關重要的作用［4］。對p53的去乙酰化、磷酸化、泛素化、sumo化和甲基化、去甲基化修飾的研究也有眾多報道。

JMJD6是JMJC結構域家族成員?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)具有JMJC結構域的蛋白多具有組蛋白去甲基化酶活性［5］。他們以亞鐵離子和α-酮戊二酸為輔助因子，可以催化賴氨酸殘基上單甲基、雙甲基和三甲基發(fā)生去甲基化［6］。關于JMJD6的功能先后有不同報道。2004年首先發(fā)現(xiàn)JMJD6具有組蛋白精氨酸去甲基化酶活性，但隨后發(fā)現(xiàn)JMJD6具有賴氨酸羥化酶活性而非精氨酸去甲基化酶活性，它參與RNA的剪接，并傾向于結合單鏈RNA［7～10］。目前關于JMJD6對p53活性的影響尚未有報道，本文旨在分析兩者的相互作用，研究JMJD6對p53靶基因轉錄活性的影響，并通過鑒定JMJD6的賴氨酸羥化酶活性探討其可能的作用機制。

材料與方法

1.材料:(1)質粒及細胞:大腸桿菌DH5α、BL21菌種由本課題組提供。HEK293T細胞和 MCF7細胞為本組保存。H1299細胞由中科院生物物理所袁增強老師惠贈。質粒pcDNA6-FLAG-p53及pCMV-Tag2B-p53各刪切片段的表達質粒由本課題組保存。POZ-JMJD6真核表達質粒由基礎所梅品超老師提供。14×p53-luciferase報告基因質粒由醫(yī)科院基礎所李雷博士提供。(2)試劑及材料:細胞培養(yǎng)基DMEM購自GIBCOBRL公司，胎牛血清購自Hyclone公司。FLAG抗體、FLAG-EZview珠子購自Sigma公司，c-Myc抗體購自Santa cruz公司，二抗辣根過氧化物酶標記的抗小鼠和抗兔IgG購自MBL公司，Glutathione sepharose 4B珠子購自GE公司，限制性內切酶購自NEB公司，T4 DNA連接酶購自Takara公司，Vigofect轉染試劑購自威格拉斯公司，IPTG購自amresco公司，雙報告熒光檢測試劑購于PROMEGA公司。生物素標記的組蛋白H4肽段(氨基酸1～23)在中科亞光公司合成。

2.方法:(1)細胞培養(yǎng):HEK293T細胞和H1299細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)條件為 5%CO2，37℃。MCF7 細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)條件為 5%CO2，37℃。(2)質粒構建:1)pCMV-3Tag-7-JMJD6真核表達質粒構建:以POZJMJD6質粒為模板，設計引物擴增JMJD6片段，經(jīng)HindⅢ和SaⅡ雙酶切;載體pCMV-3Tag-7經(jīng)HindⅢ和SaⅡ雙酶切后連接。上游引物:5'-GCG AAGCTT AACCACAAGAGCAAGAAGCG-3';下游引物:5'-GCG GTCGAC TCAGGGGTGAGCCCGGCCT-3'。2)pcDNA6-FLAG-JMJD6真核表達質粒構建:pCMV-3Tag-7-JMJD6經(jīng)HindⅢ和SaⅡ雙酶切獲得JMJD6目的片段，將SalⅠ黏性末端補齊;載體pcDNA6-FLAG經(jīng)HindⅢ和EcoRⅤ雙酶切后連接。質粒經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定，電泳可見約1.2kb片段。3)pGEX4T2-p53原核表達質粒構建:pcDNA6-FLAG-p53經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切獲得p53目的片段，載體pGEX4T2經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接。4)pGEX4T1-p53刪切片段原核表達質粒構建:pCMV-Tag2B-p53-ΔC(1～313氨基酸)，pCMV-Tag2B-p53-ΔN(96～393氨基酸)，pCMV-Tag2B-p53-core(96～313氨基酸)，pCMV-Tag2B-p53-C(314～393氨基酸)，pCMV-Tag2B-p53-ΔC，-ΔN，-core，-C 經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切獲得目的片段，載體pGEX4T1經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后分別連接。(3)原核蛋白表達純化:GST-p53各刪切體質粒轉化大腸桿菌BL21菌株，挑取單克隆37℃進行大量培養(yǎng)，至 OD550達到0.7，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG誘導，16℃培養(yǎng)20h，5000r/min收集菌體。菌體用 BC500-10(20mmol/L This pH7.9，500mmol/L NaCl，1.5mmol/L MgCl2，10%甘油，0.5%TritonX-100)重懸。加入蛋白酶抑制劑(1mmol/L PMSF，1mmol/L DTT)，混勻后超聲30s，10次。最大轉速離心收集上清，并加入 glutathione sepharose 4B 200μl，4℃ 過夜結合。收集 GST 珠子，分別用BC500-10和BC100-10(20mmol/L Tris pH7.9，100mmol/L NaCl，1.5mmol/L MgCl2，10%甘油)洗滌2次和3次，并用終濃度為10mmol/L的還原型谷胱甘肽(50mmol/L Tris pH7.9)洗脫目的蛋白。10%SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白定量。(4)細胞轉染:按威格拉斯公司Vigofect高效轉染試劑說明書進行。(5)免疫共沉淀:將pCMV-3Tag-7-JMJD6質粒分別與pcDNA6-FLAG或pcDNA6-FLAG-p53質粒共轉染HEK293T細胞，48h后用冰預冷的PBS洗滌細胞1次，將細胞吹離瓶壁，懸浮于PBS中。3000r/min、4℃離心3min。裂解緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.5，150mmol/L NaCl，2mmol/L EDTA，0.2%NP-40，1mmol/L DTT，1mmol/L PMSF，10μg/ml leupeptin，10μg/ml aprotinin)裂解細胞。將500μg蛋白裂解液稀釋至500μl的裂解緩沖液中，加入20μl protein A/G agarose珠子和1μg c-Myc抗體，將抗體-蛋白混和物于4℃旋轉儀上混勻過夜。3000r/min，4℃離心3min，去掉上清。用裂解緩沖液漂洗免疫沉淀復合物5次，收集沉淀，加入1×SDS蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸5min，免疫印記分析。(6)GST pull-down:將純化的GST和GST-p53刪切體蛋白5μg加入20μl 50%glutathione sepharose 4B珠子混懸液，輕柔混勻，4℃過夜。收集珠子，分別用BC500-10和BC100-10洗滌2次和3次。將 pCMV-3Tag-7-JMJD6質粒轉染HEK293T細胞，48h后制備全細胞抽提物。檢測蛋白濃度，取500μg蛋白，加入 RIPA-蛋白酶抑制劑至 500μl，加入 20μl 50%glutathione sepharose 4B-GST混懸液，4℃條件下輕柔混勻持續(xù)2h。500g、4℃離心5min，棄上清，RIPA洗滌珠子5次，棄上清，加入40μl 1×SDS蛋白電泳上樣緩沖液，100℃加熱5min。8%SDS-PAGE凝膠電泳，免疫印跡檢測。(7)熒光素酶雙報告基因檢測:將生長旺盛的MCF7細胞和H1299細胞用胰蛋白酶消化，鋪至24孔板，24h后轉染報告基因質粒，內參照質粒pRL-TK，及相應基因的過表達質粒。37℃、5%CO2孵育 48h，棄去培養(yǎng)基，加入 100μl細胞裂解液，室溫30min。取10μl檢測熒光素酶及Renillia活性。(8)體外羥基化實驗:生物素標記的組蛋白H4肽段(氨基酸1～23)自中科亞光公司合成，在HEK293T細胞中過表達FLAG-JMJD6，按照FLAG-EZview珠子純化方法獲得FLAG-JMJD6蛋白。底物混合物體系如下:組蛋白H4肽段(2μg)，α-酮戊二酸(500μmol/L)，抗壞血酸(100μmol/L)，溶于 Tris(50mmol/L，pH 7.5)中。酶混合物體系如下:FeNH4SO4(100μmol/L)，F(xiàn)LAG-JMJD6(0.5μg)溶于Tris(50mmol/L，pH 7.5)中。將二者混合，置于30℃反應1h。反應產物用于LC-MS分析。

3.統(tǒng)計學方法:本實驗所有比較各組間數(shù)據(jù)用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.表達載體的構建和鑒定:pGEX4T2-p53質粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，電泳可見約1.2kb片段。pGEX4T1-p53-ΔC，-ΔN，-core，-C 質粒經(jīng) EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，電泳可見相應大小的片段。JMJD6和p53各表達載體經(jīng)測序鑒定，證明構建成功，見圖1。

圖1 p53各表達載體的酶切分析

2.JMJD6與p53的免疫共沉淀分析:將pCMV-3Tag7-JMJD6及pCMV-3Tag-7空載體分別與pcDNA6-FLAG-p53共轉染HEK293T細胞，48h后收集細胞裂解液，用c-Myc標簽抗體免疫沉淀，用FLAG標簽抗體做免疫印跡，結果顯示JMJD6蛋白和p53蛋白可以相互結合，見圖2。

圖2 JMJD6與p53的免疫共沉淀分析

3.p53及其刪切體質粒的原核表達及純化:在大腸桿菌中分別表達GST-p53、GST-p53-ΔC-ΔN、-core、-C并純化，通過SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色顯示全長及各刪切體蛋白表達良好，見圖3。

4.JMJD6與p53的GST pull-down分析:利用原核表達的GST-p53蛋白全長及各刪切體與在HEK293T細胞中表達的Myc-JMJD6進行GST pull-down實驗，結果顯示，GST-p53、GST-p53-ΔN、GST-p53-C可與 JMJD6結合，而 GST-p53-ΔC和GST-p53-core不與JMJD6結合，說明JMJD6和p53蛋白可以在體外發(fā)生相互作用，p53的C端結構域是p53結合JMJD6的重要位置，見圖4。

圖3 p53及其刪切體的SDS-PAGE分析

圖4 JMJD6與p53的GST pull-down分析

5.JMJD6對p53靶基因啟動子活性的影響:將細胞鋪至24孔板，24h后轉染14×p53-Luc(包含14個串聯(lián)的p53結合元件)報告基因質粒0.1μg，內參照質粒pRL-TK 0.002μg及各組質粒，轉染48h后檢測，見圖5。

結果發(fā)現(xiàn)無論是在外源轉染p53的H1299細胞中，還是在表達野生型p53的MCF7細胞中，JMJD6均可以使14×p53-Luc的熒光素酶活性提高(P＜0.05)，激活作用依賴于p53蛋白的存在，表明JMJD6能夠促進p53的轉錄活性。

圖5 JMJD6對p53靶基因啟動子活性的影響

6.JMJD6的體外羥基化實驗:在HEK293T細胞中過表達pcDNA6-FLAG-JMJD6質粒，利用FLAG-EZview珠子免疫沉淀獲得了FLAG-JMJD6蛋白作為反應酶，以生物素標記的包含組蛋白H4的N端23個氨基酸的肽段作為底物，進行了體外羥化反應。通過質譜鑒定反應產物，結果顯示組蛋白 H4有16kDa的質量遷移，說明JMJD6催化組蛋白H4發(fā)生了羥基化反應，具有羥化酶活性。

圖6 JMJD6羥基化反應的質譜分析

討 論

組蛋白修飾和轉錄因子的翻譯后修飾研究一直備受關注［11，12］。p53蛋白作為一個重要的轉錄因子，是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子之一［1］。它參與調控DNA修復，調節(jié)細胞周期和細胞凋亡［2，3］。很多研究顯示p53蛋白的激活是一個多級多因子參與的復雜調控機制，這其中p53的翻譯后修飾發(fā)揮著至關重要的作用［4］。例如，細胞經(jīng)過紫外(UV)或γ射線處理后，p53的C端6個賴氨酸可以被p300乙?；揎?，這是激活p53轉錄活性的重要標志之一［13］。另有報道精氨酸甲基轉移酶PRMT1介導的p53-333、335、337位精氨酸甲基化修飾也會影響p53的轉錄活性［14］。除此之外，對p53的去乙?；?、磷酸化、泛素化、sumo化和賴氨酸甲基化、去甲基化修飾的研究也有眾多報道。

JMJD6是組蛋白去甲基化酶家族成員之一，并具有賴氨酸羥化酶活性，它參與RNA的剪接，并傾向于結合單鏈RNA［9，10］。本研究發(fā)現(xiàn) JMJD6可以與 p53的C端結構域發(fā)生相互作用，并激活p53的轉錄活性。在體外羥基化-質譜分析中發(fā)現(xiàn)JMJD6可以催化生物素標記的組蛋白H4肽段發(fā)生羥基化反應，這提示JMJD6作為賴氨酸羥化酶可能通過羥基化p53 C端結構域的賴氨酸調控p53的轉錄活性。另外在體外羥基化-質譜分析中同時發(fā)現(xiàn)標記組蛋白H4肽段的生物素同樣可以被JMJD6羥基化，提示JMJD6可能不具有底物選擇的特異性。

目前對p53的翻譯后修飾(包括乙酰化、去乙酰化、磷酸化、泛素化、sumo化、甲基化以及去甲基化)的研究已有眾多報道。我們相信很多翻譯后修飾相關酶類在這一過程中發(fā)揮著重要作用，這其中包括賴氨酸羥化酶JMJD6，可能通過修飾p53來調控其轉錄活性，從而參與到DNA修復，細胞周期和細胞凋亡的調控過程中。

1 Baker SJ，F(xiàn)earon ER，Nigro JM，et al.Chromosome 17 deletions and p53 gene mutations in colorectal carcinomas［J］.Science，1989，244(4901):217-221

2 Levine AJ.p53，the cellular gatekeeper for growth and division［J］.Cell，1997，88(3):323-331

3 Zhang Y，Wang JS，ChenLL，et al.Repression of hsp90beta gene by p53 in UV irradiation-induced apoptosis of Jurkat cells［J］.J Biol Chem，2004，279(41):42545-42551

4 Kruse JP，Gu W.SnapShot:p53 posttranslational modifications［J］.Cell，2008，133(5):930-30 e1

5 Tsukada Y，F(xiàn)ang J，Erdjument-Bromage H，et al.Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins［J］.Nature，2006，439(7078):811-816

6 Klose RJ，Kallin EM，Zhang Y.JmjC-domain-containing proteins and histone demethylation［J］.Nat Rev Genet，2006，7(9):715-727

7 Chang B，Chen Y，Zhao Y，et al.JMJD6 is a histone arginine demethylase［J］.Science，2007，318(5849):444-447

8 Hahn P，Wegener I，Burrells A，et al.Analysis of Jmjd6 cellular localization and testing for its involvement in histone demethylation［J］.PLoS One，2010，5(10):e13769

9 Webby CJ，Wolf A，Gromak N，et al.Jmjd6 catalyses lysyl-hydroxylation of U2AF65，a protein associated with RNA splicing［J］.Science，2009，325(5936):90-93

10 Hong X，Zang J，White J，et al.Interaction of JMJD6 with singlestranded RNA［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(33):14568-14572

11 Zhao HY，Zhang YJ，Dai H，et al.CARM1 mediates modulation of Sox2［J］.PLoS One，2011，6(10):e27026

12 Strahl BD，Allis CD.The language of covalent histone modifications［J］.Nature，2000，403(6765):41-45

13 Gu W，Roeder RG.Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain［J］.Cell，1997，90(4):595-606

14 Jansson M，Durant ST，Cho EC，et al.Arginine methylation regulates the p53 response［J］.Nat Cell Biol，2008，10(12):1431-1439