梁振洋，韓雅玲，張效林，李 毅，閆承慧，劉少偉

（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科, 沈陽 110840）

氯吡格雷可以明顯地降低急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome, ACS）和經(jīng)皮冠狀動脈介入（percutaneous coronary intervention, PCI）術(shù)后患者各類缺血事件的發(fā)生率[1-3]，但由于個體對氯吡格雷治療的反應(yīng)性不一致，有一部分PCI術(shù)后的患者在氯吡格雷規(guī)范劑量的治療過程中，仍發(fā)生了較為嚴(yán)重的血栓事件，此臨床現(xiàn)象被稱為氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance, CR）[4]。據(jù)國外文獻(xiàn)報道，CR的發(fā)生率多在 4%～30%之間[5,6]。而且，CR患者的主要心臟不良事件（major adverse cardiac events，MACE）發(fā)生率可高達(dá) 40%，明顯高于非CR者，在所有發(fā)生MACE的患者中，CR患者約占80%[7]。氯吡格雷本身不具有生物學(xué)活性，需經(jīng)肝細(xì)胞色素P450酶系的代謝后，方能具有抑制血小板活化和聚集的生物學(xué)活性，近期研究表明，CYP2C19基因[8-14]的多態(tài)性可能是影響氯吡格雷抗血小板作用的重要因素之一。

因此，評估CYP2C19基因單核苷酸多態(tài)性與老年冠心病患者PCI術(shù)后CR發(fā)生的相關(guān)關(guān)系，可為CR的早期診斷和防治提供循證醫(yī)學(xué)依據(jù)，對指導(dǎo)老年冠心病患者PCI術(shù)后氯吡格雷個體化用藥、降低缺血事件再發(fā)風(fēng)險及改善患者的遠(yuǎn)期預(yù)后，具有非常重要的意義。本研究擬通過探討在中國漢族老年冠心病患者群中CYP2C19基因多態(tài)性與CR發(fā)生的相關(guān)關(guān)系，以期為臨床早期預(yù)測及提早干預(yù)血栓事件的發(fā)生提供分子遺傳學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象

2010年6月至2011年4月，本研究共連續(xù)入選614例在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療的老年冠心病患者。入選標(biāo)準(zhǔn)為：（1）年齡≥60歲；（2）經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠心?。òú环€(wěn)定性心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死及ST段抬高型心肌梗死）；（3）接受雙聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)抗栓治療的患者，志愿參加，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）對阿司匹林或氯吡格雷過敏或不能耐受者；（2）半年內(nèi)有中風(fēng)或內(nèi)臟出血性疾病病史者；（3）嚴(yán)重肝臟疾患和（或）凝血功能異常者；（4）具有抗血小板治療禁忌證或近期擬行手術(shù)者；（5）合并其他終末期疾病者。

1.2 藥物治療方案

所有入選病例口服阿司匹林負(fù)荷量 300 mg及氯吡格雷負(fù)荷量 600 mg，血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗劑、肝素及低分子肝素由醫(yī)師根據(jù)臨床需要應(yīng)用。

1.3 血小板聚集率的測定及相關(guān)定義

所有入選病例確定已口服300 mg阿司匹林+600 mg氯吡格雷24h后，采血5～10ml，收集于含乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）的抗凝管中，30 min內(nèi)送至沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科實驗室，測定血小板聚集率。光學(xué)比濁法測定20μmol/L ADP誘導(dǎo)的最大殘余血小板聚集率[15]（residual platelet agglutination，RPA）作為評價血小板活化的指標(biāo)。以光學(xué)比濁法濃度為 20μmol/L的 ADP誘導(dǎo)的 RPA≥70%，定義為CR；RPA<70%則為NCR[16-19]。

1.4 人血白細(xì)胞基因組DNA提取及目的片段的擴(kuò)增

采用TIANamp血液白細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA，引物：F：5'-CCTATGCTATCATCTCCAAA-3'，R：5'-TACGCAAGCAGTCACATAAC-3'，預(yù)變性 94℃4min，(變性 94℃30s-退火 54℃30s-延伸 72℃40s)共 30 個循環(huán)-終延伸 72℃7min-保存于4℃。

1.5 酶切檢測rs4424285位點(diǎn)SNP基因型

擴(kuò)增CYP2C19 681G>A單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，用內(nèi)切酶SmaI (NEB公司) 于37℃酶切消化3 h后，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物（圖1）。同時，隨機(jī)選取60例PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢樣后，送至上海生工生物公司進(jìn)行焦磷酸測序復(fù)檢（圖2）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用±s表示，應(yīng)用兩樣本t檢驗（計量資料）和χ2檢驗（計數(shù)資料）比較CR組和NCR組間人口學(xué)及臨床資料之間差異的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度?；蛐皖l率和等位基因頻率在 CR組和 NCR組之間的差異用χ2檢驗，OR值和95%可信區(qū)間（95% CI）表示基因與氯吡格雷抵抗的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。多項影響因素進(jìn)行分析時，使用多元logistic回歸進(jìn)行校正。

圖1 CYP2C19基因681G>A位點(diǎn)PCR產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果Figure 1 Enzyme digestion of PCR products of CYP2C19 gene 681G> A locus

2 結(jié) 果

2.1 兩組基線臨床資料比較

614例研究對象20 μmol/L的ADP誘導(dǎo)的RPA≥70%的病例共有126例，即CR組為126例，其余對象為非氯吡格雷抵抗（non-clopidogrel resistance, NCR）組，共488例，CR總體發(fā)生率為20.5%。兩組研究對象的基線臨床資料如表1所示。兩組間患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）等一般資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。常規(guī)實驗室檢查結(jié)果及臨床藥物治療差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 研究對象的基線臨床資料Table 1 Baseline demographic and clinical characteristics of the study cohort

圖2 CYP2C19 681G>A基因型測序結(jié)果鑒定Figure 2 CYP2C19 681G>A polymorphism genotyping

2.2 Hardy–Weinberg平衡檢驗

采用χ2檢驗計算CYP2C19基因各標(biāo)簽SNP基因型的觀察頻率相對于理論頻數(shù)的偏離后，結(jié)果顯示，CYP2C19基因9個標(biāo)簽SNP的基因型在CR組和NCR組均符合遺傳學(xué)Hardy-Weinberg平衡(P均＞0.05)，提示所入選的研究對象具有良好的群體代表性。

2.3 CYP2C19 681G>A等位基因及基因型在 CR組與NCR組間的分布

運(yùn)用多元logistic回歸校正了性別、年齡、BMI、吸煙、高血壓、糖尿病、血總膽固醇、血小板計數(shù)、血肌酐、血糖、左室射血分?jǐn)?shù)、他汀類調(diào)脂藥、β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/血管緊張素受體拮抗劑（angiotensin converting enzyme inhibitor/angiotensin receptors blocker, ACEI/ARB）、質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor, PPI）之后結(jié)果顯示，CYP2C19 681G>A多態(tài)位點(diǎn)AA基因型及A等位基因分布頻率在CR組與NCR組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003，P=0.002；表2）。

3 討 論

對于冠狀動脈介入治療術(shù)后的患者，阿司匹林與氯吡格雷聯(lián)合應(yīng)用的雙聯(lián)抗血小板治療仍是目前抗栓治療的基石。但在臨床實際工作中，由于不同個體對抗栓治療的反應(yīng)性存在較大差異，故現(xiàn)行治療指南推薦的抗栓藥物治療劑量并不適合用于所有患者。而對于發(fā)生 CR的患者，為降低血栓事件的再發(fā)風(fēng)險，增加氯吡格雷劑量以及合用其他作用機(jī)制不同的抗血小板藥物是目前較為被認(rèn)可的方法。近年研究表明，采用上述方法可以在一定程度上改善患者對抗血小板治療的反應(yīng)性，但對于所有發(fā)生CR的患者均給予長期高維持劑量的氯吡格雷無疑會增加其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及出血事件的風(fēng)險，所以，理想的抗栓治療方案應(yīng)該是個體化的、有針對性的治療。由于 CR常為多因素所導(dǎo)致，包括可逆性因素（治療依從性差、藥物相互作用等）以及不可逆因素（基因多態(tài)性），故而在糾正了可逆性因素后，有些CR患者會得到較明顯的改善，并不需要長期高維持劑量的服用氯吡格雷。但對于存在不可逆因素的血栓高?；颊?，酌情給予個體化的高維持劑量的抗栓治療是有必要的。此外，由于冠心病的老齡化趨勢，老年患者日益增多，強(qiáng)化抗栓治療不但加重其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，其出血風(fēng)險較年輕患者亦明顯增加，因此，在中國漢族老年人群中大樣本、系統(tǒng)地探討CYP2C19基因多態(tài)性對氯吡格雷療效的影響，具有較為重要的臨床意義。

CYP2C19基因位于染色體10q24.1-q24.3，全長約90.2kb，9個外顯子，含有38個SNP位點(diǎn)。Mega等[11]的研究證實 CYP2C19基因 681G>A位點(diǎn)多態(tài)性可能使氯吡格雷抗血小板聚集的療效降低，并間接提示了 CYP2C19基因多態(tài)性可能影響了相關(guān)肝酶的活性，繼而對氯吡格雷的生物學(xué)代謝產(chǎn)生了作用。Mega等進(jìn)一步研究證實[20]，攜帶CYP2C19基因681G>A位點(diǎn)A等位基因的患者接受225 mg/d氯吡格雷的維持劑量，方可以達(dá)到非攜帶者 75 mg/d氯吡格雷的相近的血小板抑制率，而攜帶AA型純合子的患者即使每天接受高達(dá) 300 mg氯吡格雷的維持劑量仍然不能達(dá)到理想的血小板抑制率。上述研究對象均為高加索人群，在亞洲人種中CYP2C19編碼的酶蛋白里，CYP2C19基因681G>A位點(diǎn)的突變亦可導(dǎo)致酶蛋白的功能缺陷，其突變型純合子氯吡格雷療效低反應(yīng)的發(fā)生率約 13%～23%[21]，且明顯高于高加索人種的 1%～3%。在我們的研究中，所有入選的病例均為中國漢族老年冠心病患者，在治療期間所給予的治療方案均為嚴(yán)格遵循治療指南所進(jìn)行，故而可能影響氯吡格雷療效的可逆性因素（治療依從性差、藥物相互作用等）已盡量降至最低，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中國漢族老年冠心病患者中，CR的發(fā)生率為20.5%，攜帶CYP2C19基因681G>A單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)A等位基因的患者發(fā)生CR的風(fēng)險明顯高于非攜帶者(OR=1.85, 95% CI:1.392～2.459,P= 0.002)。而攜帶AA型純合子的患者，發(fā)生 CR的風(fēng)險較其他患者（GG型純合子及GA型雜合子）高約3倍（OR=3.03, 95% CI: 1.889～5.784,P= 0.003）。本研究通過較大樣本的關(guān)聯(lián)研究的分析，首次初步闡明了中國老年冠心病患者 CR發(fā)生與CYP2C19基因單核苷酸多態(tài)性的相關(guān)關(guān)系。

表2 CYP2C19 681G>A等位基因及基因型在CR及NCR兩組間的分布Table 2 CYP2C19 681G>A allele and genotype between CR and NCR groups [n(%)]

在本研究中，我們將PPI納為研究因素之一，但在CR及NCR兩組間未發(fā)現(xiàn)明顯差異，即PPI與CR的發(fā)生無明顯相關(guān)關(guān)系。當(dāng)前學(xué)術(shù)界對于 PPI是否增加 CR的發(fā)生風(fēng)險，尚無定論，多個臨床大型試驗[22-24]亦得出了不相一致的結(jié)論，該問題還需要進(jìn)行深入探討和研究。同時，我們的研究是回顧性分析，故不能排除標(biāo)本選擇或其他可能因素通過肝臟對氯吡格雷的代謝產(chǎn)生影響，還需要進(jìn)行一項注冊的前瞻性研究及功能學(xué)方面實驗，進(jìn)一步地深入研究與探討。

目前多數(shù)大型醫(yī)院已開展多種測定血小板聚集功能的方法，檢測CYP2C19基因的芯片也已開始應(yīng)用于臨床檢驗，相信通過更為廣泛地開展血小板聚集功能的測定及應(yīng)用藥物遺傳學(xué)分析方法，必會使心血管病患者的抗血小板治療更為個體化，使其療效更為確切。相信在不久的將來，由基因?qū)虻膫€體化藥物治療必會在臨床實踐中起到關(guān)鍵性的作用，造福于血栓性疾病的患者。

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