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高碘誘導(dǎo)小鼠海馬組織NOS陽性神經(jīng)元凋亡

2012-05-08 08:10:12張松筠楊長春
關(guān)鍵詞:濾泡組織化學(xué)海馬

王 崇,張松筠,楊長春

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科,河北石家莊050000;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北石家莊050000;3.武裝警察部隊總醫(yī)院內(nèi)一科,北京100039)

·論 著·

高碘誘導(dǎo)小鼠海馬組織NOS陽性神經(jīng)元凋亡

王 崇1,張松筠2,楊長春3

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科,河北石家莊050000;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科,河北石家莊050000;3.武裝警察部隊總醫(yī)院內(nèi)一科,北京100039)

目的觀察高碘喂養(yǎng)小鼠海馬組織一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)陽性神經(jīng)元的變化,探討高碘對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害及行為學(xué)的影響。方法選擇昆明種初斷乳健康小鼠50只(雌雄各25只),隨機分為適碘及高碘2組,適碘組小鼠喂碘濃度為50μg/L蒸餾水,高碘組小鼠喂碘濃度為5 000μg/L的蒸餾水各180d,做Morris水迷宮行為學(xué)測試,再用還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶[nicotinamide adenine dinuc1eotide phosphate (NADPH)-diaphorase,NADPH-d]組織化學(xué)染色法觀察小鼠海馬組織NOS陽性神經(jīng)元的改變。結(jié)果高碘組小鼠海馬組織NOS陽性神經(jīng)元密度較適碘組明顯降低,染色變淺;在行為學(xué)測試中,小鼠逃避潛伏期明顯延長。結(jié)論高碘組小鼠海馬組織NOS陽性神經(jīng)元減少及染色變淺,為高碘喂養(yǎng)可對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害提供了病理依據(jù)。

碘;海馬;一氧化碳合酶;小鼠

碘是人體重要的微量元素,長期碘缺乏可導(dǎo)致地方甲狀腺腫,妊娠期缺碘可造成胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良,智力低下。通過食鹽加碘等措施來預(yù)防碘缺乏病的發(fā)生,起到了明顯效果。長期過量補碘也會損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,進而影響學(xué)習(xí)記憶功能[1-2]。一氧化氮(nitric oxide,NO)是中樞神經(jīng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)及信使,對學(xué)習(xí)記憶功能起重要作用[3],而一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是催化L-精氨酸生成NO的關(guān)鍵酶,故NOS活性的高低直接影響NO的合成,進而對學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生影響。海馬組織是有關(guān)學(xué)習(xí)記憶功能的重要神經(jīng)中樞,本研究通過觀察高碘喂養(yǎng)小鼠海馬組織NOS陽性神經(jīng)元及小鼠行為學(xué)的改變,探討高碘對學(xué)習(xí)記憶功能影響的神經(jīng)機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備:初斷乳健康昆明種小鼠50只(由河北實驗動物中心提供),體質(zhì)量11~13g,雌雄各半,隨機分為適碘組與高碘組,每組25只,普通飼料喂養(yǎng),在其飲用蒸餾水中加碘酸鉀,其中適碘組碘濃度為50μg/L,高碘組碘濃度為5 000μg/L,喂養(yǎng)至第180d,對2組動物作分別做Morris水迷宮行為測試,然后斷頸處死,取甲狀腺甲醛固定、脫水、石蠟包埋,蘇木精-伊紅染色,光鏡下證實高碘組高碘甲狀腺腫模型制備成功;然后取腦進行還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶[nicotinamide adenine dinuc1eotidephosphate(NADPH)-diaphorase,NADPH-d]組織化學(xué)染色光鏡觀察海馬組織NOS陽性神經(jīng)元的變化。

1.2 動物行為學(xué)測試:按文獻[4]所介紹方法對2組動物進行Morris水迷宮行為測試,并記錄2組小鼠的逃避潛伏期。

1.3 NADPH-d組織化學(xué)反應(yīng)[5]:將腦組織用4%多聚甲醛灌注固定,置4℃冰箱過夜后,依次移入15%,30%蔗糖磷酸緩沖液中(0.1mo1/L,pH 7.4)于冰箱內(nèi)放置沉底。連續(xù)冰凍冠狀切片(所取平面限定于海齒互包平面)片厚20μm,0.1mo1/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)接片,每2~3張取一片,每例取3~4張進行NADPH-d組織化學(xué)反應(yīng),將切片用1%TritonX-100(pH 7.4)預(yù)浸60min后移入孵育液,于37℃溫箱中孵育3h,孵育液由(0.5mg NADPH-d,sigma,typeⅠ)、0.5mg硝基四氮唑藍(nitrob1ue tetrazo1ium,NBT)、1mL磷酸緩沖液(0.1mo1/L,pH 7.4)、1mL 1%TritonX-100組成;0.1mo1/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)沖洗3次,5min/次,終止反應(yīng);明膠載片裱片風(fēng)干,中性紅復(fù)染,常規(guī)脫水,透明封片。

此法神經(jīng)元顯示為藍黑色,類似Go1gi鍍銀染色外觀,胞體、神經(jīng)纖維及纖維終末均可染色。每例取5張背側(cè)海馬切片,用目鏡網(wǎng)格測試系統(tǒng)在40× 10倍顯微鏡下計數(shù)0.01mm2范圍內(nèi)的海馬組織NOS陽性神經(jīng)元數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用POMS2.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以±s表示,采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察:結(jié)果適碘組,光鏡下可見甲狀腺濾泡上皮細胞為高柱狀或單層立方狀,核圓形或橢圓形位于細胞中央,細胞質(zhì)中等,甲狀腺濾泡大小形態(tài)不一,腔內(nèi)有中等量的粉紅色膠質(zhì),毛細血管豐富(圖1)。高碘組,光鏡下可見甲狀腺濾泡上皮細胞扁平,細胞核呈梭形,濾泡間質(zhì)減少,甲狀腺濾泡明顯擴張,腔內(nèi)充滿大量染色的紅色膠質(zhì)(圖2)。以上觀察結(jié)果證實高碘組小鼠高碘甲狀腺腫模型復(fù)制成功。

2.2 行為學(xué)測試結(jié)果:高碘組小鼠平均逃避潛伏期較適碘組小鼠明顯延長(P<0.01),見表1。

表1 2組小鼠平均逃避潛伏期及海馬NOS陽性神經(jīng)元密度比較Table 1 The mean escape latency of rats and the denses of NOS-positive cells in the 2 groups (n=25,±s)

表1 2組小鼠平均逃避潛伏期及海馬NOS陽性神經(jīng)元密度比較Table 1 The mean escape latency of rats and the denses of NOS-positive cells in the 2 groups (n=25,±s)

*P<0.01 vs appropriate iodine group by t testNOS:nitric oxide synthase

GroupsThe mean escape 1atency(t/s)The density of NOS positive ce11s in hippocampus (ce11s/0.01mm2)Appropriate iodine14.5±9.63.2±1.2 Excessive iodine 30.5±12.4*0.7±0.9*

2.3 海馬組織NADPH-d組織化學(xué)染色結(jié)果:適碘組海馬內(nèi)可見排列較為規(guī)則的NOS陽性神經(jīng)元帶,胞體較小,緊貼輻射層內(nèi)緣,胞漿飽滿且呈藍色深染,突起明顯,有較多深染纖維(圖3)。高碘組海馬NOS陽性神經(jīng)元分布與適碘組一致,細胞形態(tài)以梭形或橢圓形為主,胞核不著色,胞漿淡染,細胞密度明顯降低(P<0.01),神經(jīng)元突起短小或缺如(表1,圖4)。

3 討 論

碘作為人體重要的微量元素,對人體的生長發(fā)育及智力發(fā)展起著至關(guān)重要的作用,為了預(yù)防碘缺乏病的發(fā)生,國家采取了諸如食鹽加碘等補碘措施,并長期推廣應(yīng)用,也起到了明顯的預(yù)防效果。但近年來有研究[1]表明,長期過量補碘可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害,影響學(xué)習(xí)記憶功能。高碘對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害與其抑制NOS活性和減少NO的合成有關(guān),NO作為一種新型的神經(jīng)遞質(zhì)和信息分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞中起著重要作用,而NO是以L-精氨酸為底物在NOS合酶催化下合成,高碘可能通過誘導(dǎo)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的海馬組織NOS陽性神經(jīng)元凋亡而降低NOS活性,從而減少NO的合成[6]。

楊長春等[7]報道長期高碘喂養(yǎng)可導(dǎo)致小鼠甲狀腺腫,并可使小鼠大腦皮質(zhì)、海馬組織NOS活性降低。本研究結(jié)果證實,在應(yīng)用高碘水喂養(yǎng)小鼠180d后,可致小鼠甲狀腺明顯腫大,濾泡上皮細胞扁平,核呈梭形,濾泡間質(zhì)減少,甲狀腺濾泡明顯擴張,腔內(nèi)充滿大量紅色膠質(zhì),呈現(xiàn)高碘甲狀腺腫特有的形態(tài)學(xué)改變。表明高碘甲狀腺腫動物模型復(fù)制成功。在此基礎(chǔ)上,通過對小鼠海馬組織進行NADPH-d組織化學(xué)染色,觀察高碘對小鼠海馬組織NOS陽性神經(jīng)元的影響。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬組織中NOS的分布與NADPH-d的分布十分相似,NADPH-d染色實際上反映了NOS表達情況[7]。本研究通過對高碘甲狀腺腫小鼠海馬組織NADPH-d組織化學(xué)染色,觀察到高碘小鼠海馬組織NOS陽性神經(jīng)元胞核不著色,胞漿淡染,細胞密度降低,神經(jīng)元突起短小或缺如,纖維變短。說明長期高碘喂養(yǎng)可誘導(dǎo)小鼠海馬組織NOS陽性神經(jīng)元凋亡,NOS活性降低,NO合成減少,致中樞神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞延遲或阻滯,造成高碘組小鼠平均逃避潛伏期較適碘組小鼠明顯延長。

綜上所述,高碘不僅可導(dǎo)致小鼠甲狀腺腫,而且可通過誘導(dǎo)小鼠海馬組織NOS陽性神經(jīng)元凋亡抑制NOS活性,減少NO的合成,使小鼠學(xué)習(xí)記憶功能降低。有研究證明在大鼠海馬內(nèi)注射NOS抑制劑,造成NO含量降低,可使大鼠出現(xiàn)嚴重的學(xué)習(xí)記憶功能障礙[6],說明NO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的信使分子,維持正常濃度的NO對保證學(xué)習(xí)記憶功能非常重要。由于長期高碘對海馬組織NOS陽性神經(jīng)元的損害可影響學(xué)習(xí)記憶功能,提醒大家科學(xué)補碘,切不可長期過量補碘或濫用碘劑。(本文圖見封二)

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(本文編輯:趙麗潔)

EXCESSIVE IODINE INDUCES NITRIC OXIDE SYNTHASE POSITIVE NEURONS APOPTOSIS IN HIPPOCAMPUS OF MICE

WANG Chong1,ZHANG Songyun2,YANG Changchun3
(1.Department of Clinical Laboratory,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China;2.Department of Endocrinology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China;3.The First Department of Internal Medicine,Arm Police General Hospital,Beijing 100039,China)

ObjectiveTo observe the effect of excessive iodine on nitric oxide synthase(NOS)positive neurons in hippocampus of mice and exp1ore the injury effect of excessive iodine on centra1 nervous system.MethodsFifty mice,divided into two groups at random(contro1 group with appropriate iodine and tria1 group with excessive iodine),were fed with disti11ed water containing iodine 50μg/L and 5 000μg/L respective1y.The mice were ki11ed at 6 months after Morris water maze.Nicotinamide adenine dinuc1eotide phosphate(NADPH)-diaphorase histochemistry was used to visua1ize NOS positive ce11s in hippocampus.ResultsThe mean escape 1atency increased and NOS positive ce11s decreased significant1y in excessive iodine group than in contro1 group.ConclusionThe reduce of NOS positive ce11s in hippocampus may be re1ated to the injury of cognition in excessive iodine mice.

iodine;hippocampus;nitric oxide synthase;mice

R329.481

A

1007-3205(2012)10-1117-03

2012-03-24;

2012-06-12

河北省科技廳科研指導(dǎo)課題(062761830)

王崇(1972-),男,河北安平人,河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院副主任醫(yī)師,醫(yī)學(xué)碩士,從事臨床檢驗研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.10.001

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