劉 濤，李占林，王 宇，田 黎，裴月湖，華會(huì)明

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110001；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 創(chuàng)新藥物研究與設(shè)計(jì)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.國(guó)家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061；4.青島科技大學(xué)，山東 青島 266042)

自20世紀(jì)70年代以來，海洋微生物作為一種新藥篩選資源，因其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)獨(dú)特、活性顯著、易于工業(yè)化操作等優(yōu)勢(shì)而倍受關(guān)注[1]，尤其是在抗腫瘤藥物領(lǐng)域有著巨大潛力[2]。

為了尋找新的抗腫瘤活性成分，作者對(duì)海洋來源真菌Hypocreavirens的菌絲體進(jìn)行了化學(xué)成分研究，共分離得到8個(gè)化合物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)菌株于2007年12月采自廣西沙田潮間帶正紅樹(Rhizophoraapiculata)。由國(guó)家海洋局第一海洋研究所、青島科技大學(xué)田黎教授鑒定為真菌Hypocreavirens。菌株保存編號(hào)：HTTA-Z07723，存放于科技部資助的國(guó)家海洋局第一海洋研究所藥用海洋微生物菌種資源庫(kù)。

1.2 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用試劑為分析純或色譜純。

開放ODS柱色譜填料(100 μm),日本YMC公司；Sephadex LH-20，GE healthcare；柱色譜硅膠(200～300目)及薄層色譜硅膠，青島海洋化工廠；Bruker ARX-300型和AV-600型核磁共振儀；L2130型HPLC(檢測(cè)器為L(zhǎng)2400型)，日本HITACHI公司；YMC-Pack ODS-AM:10 mm×250 mm。

1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：燕麥浸汁200 mL，蛋白胨3 g，酵母粉2 g，葡萄糖12 g，NaCl 15 g，MgCl2· 6H2O 1.0 g，KCl 0.1 g，F(xiàn)ePO40.01 g，水1000 mL。

1.4 提取分離

取菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，于25℃、15 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 d，發(fā)酵量60 L。

發(fā)酵液經(jīng)過濾得菌絲體243 g(干重)。菌絲體經(jīng)反復(fù)“冷凍-融化”處理后，用4 BV丙酮提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓回收溶劑得浸膏97 g。

菌絲體丙酮提取物經(jīng)硅膠柱色譜，用氯仿-甲醇(100∶0～0∶100)進(jìn)行梯度洗脫，得到219個(gè)流分(每流分800 mL)。

第5流分經(jīng)重結(jié)晶得到化合物Ⅲ(5 mg)；第4～11流分合并，經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-丙酮(40∶1～0∶100)進(jìn)行梯度洗脫。第12亞流分經(jīng)重結(jié)晶得到化合物Ⅱ(2 mg)。第58～59亞流分合并，經(jīng)重結(jié)晶得到化合物Ⅵ(5 mg)。第67～72亞流分合并，經(jīng)開放ODS柱色譜及HPLC進(jìn)一步處理得到化合物Ⅰ(2 mg)。第84～87亞流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，得到化合物Ⅴ(3 mg)。第27～31流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜及開放ODS柱色譜得到化合物Ⅳ(6 mg)。第39～43流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，得到第14～16亞流分，經(jīng)開放ODS、Sephadex LH-20及硅膠柱色譜得到化合物Ⅷ(3 mg)。第51～60流分合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，得到第22～28亞流分，經(jīng)開放ODS及硅膠柱色譜得到化合物Ⅶ(4 mg)。

2 結(jié)果與討論

化合物Ⅰ的NMR數(shù)據(jù)見表1、化合物Ⅲ～Ⅷ的13CNMR數(shù)據(jù)見表2。

化合物Ⅰ：白色無(wú)定形粉末。1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ,ppm：2.31(3H，s)，1.08(3H，d，J=6.6 Hz)，0.93(3H，d，J=6.8 Hz)，0.86(3H，d，J=7.0 Hz)，0.82(3H，d，J=7.0 Hz)，0.48(3H，s)，共6個(gè)甲基，提示該化合物可能為麥角甾類。其中2.31(3H，s)不同于一般麥角甾的角甲基，處于較低場(chǎng)，推測(cè)為連接在芳環(huán)或羰基上的甲基。5.20(1H，m)、5.24(1H，m)應(yīng)為側(cè)鏈22、23位雙鍵上的質(zhì)子信號(hào)。6.65(1H，s)推測(cè)為芳?xì)湫盘?hào)。13CNMR(150 MHz,CDCl3)，δ,ppm：138.4，136.2，135.5，135.2，133.9，132.4，131.2，124.0，共8個(gè)sp2雜化碳信號(hào)，其中135.5、132.4為側(cè)鏈22、23位雙鍵上特征的碳信號(hào)。剩余6個(gè)碳信號(hào)中有5個(gè)季碳，推測(cè)為芳環(huán)的結(jié)構(gòu)，在普通麥角甾骨架中無(wú)法得到滿足，因此推測(cè)該化合物可能為變形的麥角甾類化合物。根據(jù)H-12(δH1.71，m和δH2.72，dd，J=8.2 Hz，13.2 Hz)與C-11(δ67.6)、C-9(δ133.9)、C-13(δ45.2)之間的HMBC相關(guān)確定了OH-11的取代位置。根據(jù)H-1(δH2.82，m；2.90，m)和H-2(δH1.77，m；2.01，m)之間的1H-1H COSY相關(guān)，H-3(δH4.21，m)和H-2(δH1.77，m)、H-4(δH3.03，dd)之間的1H-1H COSY相關(guān)，以及NOESY譜中H-4(δH3.03，dd)與CH3-19(δH2.31，s)之間存在的相關(guān)，確定OH-3的取代位置，見圖1。

根據(jù)H-4的偶合常數(shù)(J=16.8 Hz，8.1 Hz，J=16.8 Hz，5.0 Hz)，推測(cè)H-3處于直立鍵(通過搭建分子模型判斷并結(jié)合生物合成來源)，因此OH-3為α構(gòu)型。H-11(δH5.15，m)與CH3-18(δH0.48，s)的NOESY相關(guān)，表明H-11為β取向，則OH-11為α構(gòu)型。結(jié)合以上信息并參照文獻(xiàn)[3]，鑒定化合物Ⅰ為1(10→6)Abeo-(22E，24R)-ergosta-5，7，9，22-tetraene-3α，11α-diol，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

表1 化合物Ⅰ的NMR數(shù)據(jù)

圖1 化合物Ⅰ的重要1H-1H COSY和HMBC相關(guān)(a)、NOESY(b)相關(guān)

化合物Ⅱ：無(wú)色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，UV 365 nm下有微弱淡藍(lán)色熒光，10% 硫酸乙醇顯紫紅色(顯色后UV 365 nm下呈粉紅色熒光)。1HNMR(300 MHz，CDCl3)，δ,ppm:4.73(1H，br s，H-28a)，4.67(1H，d，J=1.2 Hz，H-28b)，3.24(1H，dd，J=4.8 Hz，11.4 Hz，H-3)，1.04(3H，d，J=6.9 Hz，H-26 or H-27)，1.03(3H，d，J=6.9 Hz，H-27 or H-26)，1.01(3H，s，H-29)，0.99(3H，s，H-19)，0.93(3H，d，J=6.3 Hz，H-21)，0.89(3H，s，H-31)，0.82(3H，s，H-30)，0.70(3H，s，H-18)。13CNMR(150 MHz，CDCl3)，δ,ppm:156.9(C-24)，134.4(C-8 and C-9)，105.9(C-28)，79.0(C-3)，50.4(C-17 and C-5)，49.8(C-14)，44.5(C-13)，38.9(C-4)，37.0(C-10)，36.5(C-20)，35.6(C-1)， 35.0(C-22)， 33.8(C-25)，31.3(C-23)，31.0(C-12)，30.8(C-15)，28.2(C-16)，27.9(C-29)，27.8(C-2)，26.5(C-7)，24.3(C-31)，22.0(C-26)，21.9(C-27)，21.0(C-11)，19.1(C-19)，18.7(C-21)，18.2(C-6)，15.7(C-18)，15.4(C-30)。結(jié)合以上信息并參照文獻(xiàn)[4]，鑒定化合物Ⅱ?yàn)?4-甲烯基羊毛脂烷-8-烯-3β-醇(24-Methylenelanostane-8-ene-3β-ol)，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

圖2 化合物Ⅰ～Ⅷ的結(jié)構(gòu)式

化合物Ⅲ：無(wú)色針狀結(jié)晶(乙酸乙酯)，UV 254 nm呈明顯暗斑，10% 硫酸乙醇顯紫黑色。1HNMR(300 MHz，CDCl3)，δ,ppm:5.59(1H，dd，J=5.7 Hz，2.6 Hz，H-6)，5.41(1H，m，H-7)，5.24(1H，dd，J=15.7 Hz，6.9 Hz，H-23)，5.16(1H，dd，J=15.7 Hz，6.9 Hz，H-22)，3.65(1H，m，H-3)，2.47(1H，ddd，J=11.7 Hz，4.5 Hz，2.2 Hz，H-4b)，2.29(1H，t，J=11.7 Hz，H-4a)，1.06(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.96(3H，s，H-19)，0.93(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J=6.6 Hz，H-26)，0.62(3H，s，H-18)。13CNMR 數(shù)據(jù)見表2。與對(duì)照品共薄層，并與文獻(xiàn)[5]中數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致,鑒定化合物Ⅲ為(22E，24R)-麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇[(22E，24R)-Ergosta-5，7，22-triene-3β-ol]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

化合物Ⅳ：無(wú)色針狀結(jié)晶(甲醇)，10% 硫酸乙醇顯墨綠色。1HNMR(300 MHz，CDCl3)，δ,ppm:5.20(2H，m，H-22，23)，4.23(1H，br s，H-6)，3.94(1H，m，H-3)，3.31(1H，m，H-7)，1.14(3H，s，H-19)，1.02(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.91(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J=6.3 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J=6.3 Hz，H-26)，0.59(3H，s，H-18)。13CNMR 數(shù)據(jù)見表2。與文獻(xiàn)[6]中數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，鑒定化合物Ⅳ為(22E，24R)-麥角甾-8，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇[(22E，24R)-Ergosta-8，22-diene-3β，5α，6β，7α-tetraol]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

表2 化合物Ⅲ～Ⅷ的13CNMR數(shù)據(jù)

化合物Ⅴ：無(wú)色粒狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，10% 硫酸乙醇顯褐色(顯色后UV 365 nm下呈黃褐色熒光)。1HNMR(300 MHz，C5D5N)，δ,ppm:5.82(1H，m，H-7)，5.25(1H，dd，J=15.5 Hz，6.9 Hz，H-23)，5.16(1H，dd，J=15.5 Hz，6.9 Hz，H-22)，4.49(1H，m，H-6)，4.25(1H，br s，H-3)，1.58(3H，s，H-19)，1.03(3H，d，J=6.3 Hz，H-21)，0.95(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.86(3H，d，J=6.9 Hz，H-27)，0.85(3H，d，J=6.9 Hz，H-26),0.68(3H，s，H-18)。13CNMR 數(shù)據(jù)見表2。結(jié)合以上信息并參照文獻(xiàn)[7]，鑒定化合物Ⅴ為5α，9α-過氧-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，6β-二醇[5α，9α-Epidioxy-(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，6β-diol]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

化合物Ⅵ：無(wú)色針晶(乙酸乙酯)，10% 硫酸乙醇顯墨綠色。1HNMR(300 MHz，CDCl3)，δ,ppm:6.51(1H，d，J=8.6 Hz，H-7)，6.23(1H，d，J=8.6 Hz，H-6)，5.21(1H，dd，J=15.5 Hz，7.8 Hz，H-22)，5.16(1H，dd，J=15.5 Hz，7.8 Hz，H-23)，3.98(1H，m，H-3)，1.00(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-28)，0.87(3H，s，H-19)，0.83(3H，d，J=6.5 Hz，H-27)，0.82(3H，s，H-18)，0.81(3H，d，J=6.5 Hz，H-26)。13CNMR數(shù)據(jù)見表2。與對(duì)照品共薄層，并與文獻(xiàn)[8]中數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，鑒定化合物Ⅵ為5α，8α-過氧-(22E，24R)-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇[5α，8α-Epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-diene-3β-ol]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

化合物Ⅶ：無(wú)色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，10% 硫酸乙醇顯墨綠色(未加熱)，加熱后顯紫紅色。1HNMR(300 MHz，C5D5N),δ,ppm:5.74(1H，m，H-7)，5.26(1H，dd，J=15.5 Hz，6.9 Hz，H-22)，5.18(1H，dd，J=15.5 Hz，6.9 Hz，H-23)，4.83(1H，m，H-6)，4.32(1H，m，H-3)，1.54(3H，s，H-19)，1.05(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.96(3H，d，J=6.9 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J=6.4 Hz，H-27)，0.84(3H，d，J=6.4 Hz，H-26)，0.66(3H，s，H-18)。13CNMR 數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)與對(duì)照品共薄層，并參照文獻(xiàn)[9],鑒定化合物Ⅶ為(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇[(22E，24R)-Ergosta-7，22-diene-3β，5α，6β-triol]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

化合物Ⅷ：白色無(wú)定形粉末，10% 硫酸乙醇顯黃褐色。1HNMR(300 MHz，C5D5N),δ,ppm:8.62(1H，s，5-OH)，6.27(2H，br s，3，9-OH)，5.93(1H，d，J=2.1 Hz，H-7)，5.27(1H，dd，J=15.2 Hz，7.3 Hz，H-23)，5.18(1H，dd，J=15.2 Hz，7.3 Hz，H-22)，4.63(1H，m，H-3)，1.15(3H，s，H-19)，1.04(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.96(3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.86(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.85(3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.64(3H，s，H-18)。13CNMR 數(shù)據(jù)見表2。經(jīng)與對(duì)照品共薄層，并參照文獻(xiàn)[10],鑒定化合物Ⅷ為3β，5α，9α-三羥基-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-6-酮[3β，5α，9α-Trihydroxy-(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-6-one]，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

3 結(jié)論

從海洋來源真菌Hypocreavirens的菌絲體中共分離得到8個(gè)化合物，分別為1(10→6)Abeo-(22E，24R)-ergosta-5，7，9，22-tetraene-3α，11α-diol(Ⅰ)、24-甲烯基羊毛脂烷-8-烯-3β-醇(Ⅱ)、(22E，24R)-麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇(Ⅲ)、(22E，24R)-麥角甾-8，22-二烯-3β，5α，6β，7α-四醇(Ⅳ)、5α，9α-過氧-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，6β-二醇(Ⅴ)、5α，8α-過氧-(22E，24R)-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇(Ⅵ)、(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇(Ⅶ)、3β，5α，9α-三羥基-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-6-酮(Ⅷ)。其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ均為首次從該屬真菌中分離得到，化合物Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ為首次從該種真菌中分離得到。

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