劉 靚,婁 忻,張 莉,關(guān)亞鵬

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國家工程研究中心，河北 石家莊 050015)

近年來，棘白霉素類抗真菌藥發(fā)展迅猛，已有卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈等多個廣譜、低毒、高效的新化合物進(jìn)入了臨床研究[1～3]。FR901379為棘白霉素類化合物米卡芬凈的前體物質(zhì)，在合成米卡芬凈時需要將其通過脫?；缸饔妹撊ヵ；筮B接其它側(cè)鏈。

均勻設(shè)計(jì)的數(shù)學(xué)原理是數(shù)論中的一致分布理論，著重在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)考慮實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻散布以求通過最少的實(shí)驗(yàn)來獲得最多的信息，因而其實(shí)驗(yàn)次數(shù)比正交設(shè)計(jì)明顯減少，特別適合于多因素多水平的實(shí)驗(yàn)[4，5]。

作者對棘白霉素類化合物脫?；府a(chǎn)生菌ZH-020的轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行研究，確定了最佳轉(zhuǎn)化條件，并通過均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了其發(fā)酵培養(yǎng)基的配方。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種

供試菌株為ZH-020。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖，酵母粉，麥芽粉，F(xiàn)eSO4·7H2O，ZnSO4，MnCl2，瓊脂，蒸餾水配制，pH值7.2。

種子培養(yǎng)基：糊精，蔗糖，酵母粉，磷酸氫二鉀，玉米漿，F(xiàn)eSO4·7H2O，蒸餾水配制，pH值7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，蔗糖，磷酸二氫鉀，無水硫酸鎂。

1.3 搖瓶培養(yǎng)

單菌落轉(zhuǎn)接于斜面上，待長出豐滿孢子后接入種子培養(yǎng)基中，置于30 ℃、220 r·min-1的搖床培養(yǎng)48 h左右；然后按3%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30 ℃、220 r·min-1的搖床培養(yǎng)96 h左右。加入底物，轉(zhuǎn)化一段時間后，采用HPLC法測定最終發(fā)酵效價(μg·mL-1),依下式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：

1.4 轉(zhuǎn)化條件實(shí)驗(yàn)

以ZH-020為出發(fā)菌株，分別在25 ℃和30 ℃的條件下，向發(fā)酵液中加入不同濃度(1000 mg·L-1、1200 mg·L-1、1400 mg·L-1)的底物FR901379，并改變轉(zhuǎn)化時間(20 h、24 h、28 h)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化條件實(shí)驗(yàn)，確定最佳轉(zhuǎn)化條件。

1.5 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

設(shè)花生餅粉、葡萄糖、蔗糖、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂5個因素分別為自變量X1、X2、X3、X4、X5，相對轉(zhuǎn)化率為因變量Y1，采用均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對ZH-020發(fā)酵培養(yǎng)基的配方進(jìn)行優(yōu)化。均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素和水平見表1。

表1 U12(65)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素和水平/%

2 結(jié)果與討論

2.1 轉(zhuǎn)化條件的確定

轉(zhuǎn)化條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 不同轉(zhuǎn)化條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，底物濃度為1000 mg·L-1時，相同溫度下轉(zhuǎn)化20 h的轉(zhuǎn)化率較高；隨著底物濃度的增大，轉(zhuǎn)化率有所下降；底物濃度增至1200～1400 mg·L-1，延長轉(zhuǎn)化時間至24 h，轉(zhuǎn)化率明顯升高；繼續(xù)延長轉(zhuǎn)化時間至28 h，轉(zhuǎn)化率反而下降。此外，菌株在30 ℃的轉(zhuǎn)化率高于25 ℃的轉(zhuǎn)化率。因此，選擇最佳轉(zhuǎn)化條件為：底物濃度1200 mg·L-1、轉(zhuǎn)化時間24 h、轉(zhuǎn)化溫度30 ℃，在此條件下，轉(zhuǎn)化率達(dá)到73.28%。

2.2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)V4.0版軟件進(jìn)行分析，采用前進(jìn)法得到相對轉(zhuǎn)化率(Y1)對5個因素花生餅粉(X1)、葡萄糖(X2)、蔗糖(X3)、磷酸二氫鉀(X4)、無水硫酸鎂(X5)的回歸方程(R2=0.9986)為：

表3 U12(65)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由回歸方程可見，花生餅粉和無水硫酸鎂對相對轉(zhuǎn)化率有較為顯著的正交互作用，而蔗糖和無水硫酸鎂對相對轉(zhuǎn)化率有較為顯著的負(fù)交互作用。

回歸方程各項(xiàng)參數(shù)的方差分析見表4，得到的綜合最優(yōu)解見表5。

表4 回歸方程的方差分析

表5 綜合最優(yōu)解

由表4可知，相關(guān)系數(shù)R2值和P值都很合理，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，說明方程擬合度高，有極其顯著的意義。各因素對相對轉(zhuǎn)化率的影響見圖1。

圖1 各因素對相對轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1可以看出，葡萄糖對相對轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生負(fù)影響，無水硫酸鎂對相對轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生正影響，花生餅粉和蔗糖對相對轉(zhuǎn)化率的影響并不顯著，磷酸二氫鉀對相對轉(zhuǎn)化率的影響較復(fù)雜，有明顯最優(yōu)值出現(xiàn)。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用表5得到的綜合最優(yōu)解配方(花生餅粉2.5%，葡萄糖1.3%，蔗糖1.0%，磷酸二氫鉀0.1%，無水硫酸鎂0.05%)進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表6。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方的轉(zhuǎn)化率較對照提高了33.29%(由于實(shí)驗(yàn)中各種因素的影響，比數(shù)學(xué)模型計(jì)算出的綜合最優(yōu)解43.3014%要低一些)。

3 結(jié)論

(1)確定了棘白霉素類化合物脫?；府a(chǎn)生菌ZH-020的最佳轉(zhuǎn)化條件為：底物濃度1200 mg·L-1、轉(zhuǎn)化時間24 h、轉(zhuǎn)化溫度30 ℃。增加底物的添加量，可以更加充分地發(fā)揮菌體產(chǎn)酶活性。后續(xù)研究可以嘗試?yán)^續(xù)增加底物的添加量，但應(yīng)注意目的產(chǎn)物與雜質(zhì)的比率；對于轉(zhuǎn)化時間應(yīng)精確把握，防止轉(zhuǎn)化的目的產(chǎn)物生成其它雜質(zhì)。

(2)通過均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定ZH-020的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：花生餅粉2.5%、葡萄糖1.3%、蔗糖1.0%、磷酸二氫鉀0.1%、無水硫酸鎂0.05%，采用此配方的轉(zhuǎn)化率比對照提高了33.29%。后續(xù)研究還可以通過更多的均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)更好地掌握碳源、氮源、無機(jī)鹽等之間的交互關(guān)系，進(jìn)一步優(yōu)化配方，提高轉(zhuǎn)化率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳由頁，曹國穎，傅得興，等.棘白霉素類抗真菌藥的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2007,16(14)：1082-1087.

[2] 葉麗娟，朱輝，田敏.微生物來源的真菌細(xì)胞壁抑制劑的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊，2005,26(1)：34-41.

[3] 蔣正立，林建群，陳文紅.棘白霉素類抗真菌藥的研究新進(jìn)展[J].天津藥學(xué)，2005，17(5)：62-64.

[4] 方開泰，馬長興.正交與均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：83-88，153-156.

[5] 劉省偉，趙德.用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化達(dá)托霉素發(fā)酵培養(yǎng)基[J].中國抗生素雜志，2011，36(3)：S4-S7.