淡小艷，王芳，薛佳爾，謝依錦

摘要：用不同溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、去離子水）于室溫對橘皮進行提取，得到不同溶劑的橘皮提取物。研究５種溶劑的橘皮提取物對１，１－二苯基－２－苦基肼（ＤＰＰＨ）和亞硝酸鹽的清除能力，并考察其有效成分的含量。結(jié)果表明，５種溶劑的橘皮提取物均具有清除ＤＰＰＨ和亞硝酸鹽的能力，其中乙酸乙酯提取物的清除能力最強。在５種溶劑的橘皮提取物中檸檬苦素含量有極顯著差異，黃酮、總酚的含量也如此；而氯仿提取物和石油醚提取物的單寧含量差異不顯著，其他３種提取物的單寧含量差異極顯著。乙酸乙酯提取物中各有效成分含量均最高，且相關(guān)性分析表明，橘皮提取物清除ＤＰＰＨ和亞硝酸鹽的能力與其黃酮含量之間存在顯著的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：橘皮；提取物；１，１－二苯基－２－苦基肼（ＤＰＰＨ）；亞硝酸鹽；抗氧化能力；有效成分

中圖分類號：ＴＳ２０２．３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）14－3052-04

Antioxidant Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｏｒａｎｇｅ Ｐｅｅｌｓ and Its Effectire Components

ＤＡＮ Ｘｉａｏ－ｙａｎ，ＷＡＮＧ Ｆａｎｇ，ＸＵＥ Ｊｉａ－ｅｒ，ＸＩＥ Ｙｉ－ｊｉｎｇ

(College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, Zhejiang, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｏｒａｎｇｅ ｐｅｅｌｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｅｔｈｅｒ， ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ， ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ， ｎ－ｂｕｔｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ． Ｔｈｅ ＤＰＰＨ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｔｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ５ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ； ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｍａｉｎ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｒａｎｇｅ ｐｅｅｌｓ ｈａｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｔｅ－ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｅｘｔｒａｃｔ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｉｍｏｎｉｎ， ｆｌａｖｏｎｏｉｄ， ｔｏｔａｌ ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ ａｎｄ ｔａｎｎｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎt． Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｅｘｔｒａｃｔ； ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｔｅ－ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｏｒａｎｇｅ ｐｅｅｌｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｏｒａｎｇｅ ｐｅｅｌ； ｅｘｔｒａｃｔ； ＤＰＰＨ； ｎｉｔｒｉｔｅ； antioxidant ａｂｉｌｉｔｙ； effective component

柑橘為中國著名果品之一，年產(chǎn)量超過１０７ ｔ［１］。橘皮約占柑橘質(zhì)量的２０％～４０％，除含維生素Ｃ、精油外，還含有豐富的黃酮類物質(zhì)［２，３］。近年來，國內(nèi)外關(guān)于橘皮抗氧化成分的研究較多，并取得了較大的進展。已有的報道表明天然橘皮中含有的黃酮類、酚類、精油、色素類、檸檬苦素等都是具有開發(fā)潛力的抑菌和抗氧化的化學(xué)成分［４－６］。隨著人們對食品安全的關(guān)注程度不斷加大，開發(fā)能夠清除食品中亞硝酸鹽的天然活性物質(zhì)具有廣闊的市場前景。目前橘皮的天然提取物對亞硝酸鹽清除能力的研究尚未見報道，以橘皮為研究材料，分別使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、去離子水５種不同極性的溶劑進行常壓提取，測定５種提取物對１，１－二苯基－２－苦基肼（ＤＰＰＨ）和亞硝酸鹽的清除能力，并分析其中有效成分的含量，旨在為橘皮的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料與試劑柑橘購自浙江省金華市水果市場，于４５ ℃條件下將新鮮橘皮烘干，用粉碎機粉碎得橘皮粉，于４ ℃保存?zhèn)溆?；ＤＰＰＨ購自日本和光純藥工業(yè)株式會社，檸檬苦素標準品購自上海銳谷生物科技有限公司；其余試劑均為分析純，購自金華市醫(yī)藥有限公司。

１．１．２儀器與設(shè)備料理機購自九陽股份有限公司，ＤＺＦ－９１４０Ｂ型真空干燥箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，Ｒ－１００１－Ｌ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司，ＵＶ１０００紫外可見分光光度計購自上海天美科學(xué)儀器有限公司。

１．２方法

１．２．１５種溶劑的橘皮提取物的制備?。担?ｇ橘皮粉，分別加入５００ ｍＬ石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和去離子水，提取６ ｈ，離心，收集上清液，再同法提取３次。合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，回收溶劑。將濃縮后的樣品放入５５ ℃烘箱中烘干，得到５種膏狀提取物，于４ ℃冰箱中備用。

１．２．２對ＤＰＰＨ清除能力的測定精確稱?。保玻?ｍｇ ＤＰＰＨ，用無水乙醇溶解并定容于２５０ ｍＬ容量瓶中，ＤＰＰＨ濃度為０．１２ ｍｍｏｌ／Ｌ，避光保存［７］。

將不同溶劑提取物用無水乙醇配成濃度為０．０５、０．１０、０．２０、０．４０和０．８０ ｍｇ／ｍＬ的樣品液，?。?ｍＬ待測樣品，加入２ ｍＬ ０．１２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＰＰＨ溶液，混勻避光放置３０ ｍｉｎ，在５１７ ｎｍ處測其吸光度（Ａｉ）；以溶劑為參比，于５１７ ｎｍ處測定吸光度（Ａｃ）；同時，取待測樣品２ ｍＬ，加入２ ｍＬ無水乙醇，混勻，于５１７ ｎｍ處測定吸光度（Ａｊ）。ＤＰＰＨ清除率＝［１－（Ａｉ－Ａｊ）／Ａｃ］×１００％。

１．２．３對亞硝酸鹽清除能力的測定采用鹽酸萘乙二胺法［８］。向２５ ｍＬ比色管中加入２ ｍＬ ２５ μｇ／ｍＬ ＮａＮＯ２標準溶液、３ ｍＬ樣品液（不同提取物用去離子水配成的，濃度為０．０５、０．１０、０．２０、０．４０、０．８０ ｍｇ／ｍＬ），迅速加入適量０．０５ ｍｏｌ／Ｌ HCl調(diào)至ｐＨ ３，于８０ ℃水浴１０ ｍｉｎ，然后加入１ ｍＬ ４ ｇ／Ｌ對氨基苯磺酸混合均勻，靜置３～５ ｍｉｎ，加入０．５ ｍＬ ２ ｇ／Ｌ鹽酸萘乙二胺，振蕩混勻，加去離子水定容至２５ ｍＬ，靜置１５ ｍｉｎ，以相應(yīng)的試樣空白調(diào)零，測定５３８ ｎｍ波長處的吸光度（Ａ樣品），亞硝酸鹽清除率按以下公式計算：清除率＝［１－（Ａ樣品－Ａ樣空）／Ａ對照］×１００％，式中，Ａ對照為用３ ｍＬ去離子水代替對應(yīng)體積的樣品液試驗測得的吸光度；Ａ樣空為用２ ｍＬ去離子水代替２ ｍＬ 25 μｇ／mＬ ＮａＮＯ２標準溶液試驗測得的吸光度。

１．２．４有效成分含量的測定方法

１）總酚含量的測定。采用Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａlteu試劑比色法［９］。精確稱?。埃埃埃?ｇ沒食子酸標準樣品，用去離子水溶解并定容至５０ ｍＬ，標準溶液濃度為０．１ ｍｇ／ｍＬ。準確量取上述標準溶液０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ ｍＬ于７個５０ ｍＬ容量瓶中，各加３０ ｍＬ去離子水，搖勻，再加２．５ ｍＬ福林酚試劑，充分搖勻。１ ｍｉｎ后加入７．５ ｍＬ ２００ ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３溶液，混勻。在７５ ℃水浴反應(yīng)１０ ｍｉｎ，于７６０ ｎｍ波長下測定吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線。用最小二乘法作線性回歸。按照同樣的方法測定樣品的吸光度，帶入得到的標準方程中即可得到樣品總酚的濃度，從而得到提取物總酚的含量。

２）黃酮含量的測定。稱取２０ ｍｇ蘆丁，用體積分數(shù)為１０％的乙醇定容至２５ ｍＬ，備用。?。分Ь呷嚬?，分別加入０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ ｍＬ蘆丁標準溶液，用體積分數(shù)為３０％的乙醇補足體積至５ ｍＬ，混勻，各加入０．３ ｍＬ ５０ ｇ／Ｌ ＮａＮＯ２，混勻靜置５ ｍｉｎ，加入０．３ ｍＬ １００ ｇ／Ｌ Ａｌ（ＮＯ３）３，混勻后靜置６ ｍｉｎ，加入４ ｍＬ １ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ，再加入０．４ ｍＬ 體積分數(shù)為３０％的乙醇使總體積為１０ ｍＬ，混勻后靜置１０ ｍｉｎ，用ＵＶ１０００紫外可見分光光度計于５１０ ｎｍ處測定吸光度，以試劑為空白參比。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線。用最小二乘法作線性回歸。按照同樣的方法測定樣品的吸光度，帶入得到的標準方程中即可得到樣品黃酮的濃度［１０］，從而得到提取物黃酮的含量。

３）單寧含量的測定。采用香草醛比色法［１１］。準確稱?。埃埃?ｇ單寧溶于５０ ｍＬ甲醇中，分別取上述標準溶液０、０．５、１．０、１．５、２．０ ｍＬ，依次加入２．０、１．５、１．０、０．５、０ ｍＬ甲醇，然后加２ ｍＬ ４０ ｇ／Ｌ香草醛溶液和１．０ ｍＬ濃鹽酸，于３０ ℃水浴加熱２０ ｍｉｎ，冷卻，在５１０ ｎｍ處測定吸光度。以單寧濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線。用最小二乘法作線性回歸。按照同樣的方法測定樣品的吸光度，帶入得到的標準方程中即可得到樣品單寧的濃度，從而得到提取物單寧的含量。

４）檸檬苦素含量的測定。反應(yīng)液的制備：將１２５ ｍｇ對二－甲氨基苯甲醛溶解于１００ ｍＬ體積比為３５∶６５的硫酸、無水乙醇混合液中，加入０．５ ｍＬ ９ ｇ／Ｌ三氯化鐵溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。標準曲線的制作：將檸檬苦素標準品用無水甲醇配成１３０ μｇ／ｍＬ的標準溶液，在６支試管中分別加入０、０．５、０．８、１．２、１．５和２．０ ｍＬ標準溶液，分別加無水乙醇至２．０ ｍＬ，加入反應(yīng)液５．０ ｍＬ，搖勻，靜置３０ ｍｉｎ，在５００ ｎｍ處測定吸光度，以空白溶液為參比溶液。以檸檬苦素濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線。用最小二乘法作線性回歸。按照同樣的方法測定樣品的吸光度，帶入得到的標準方程中即可得到樣品檸檬苦素的濃度［１２］，從而得到提取物檸檬苦素的含量。

２結(jié)果與分析

２．１有效成分含量測定中各標準方程的建立

１）總酚含量的測定。吸光度（ｙ）與沒食子酸濃度（ｘ//μｇ/ｍＬ）的標準曲線的標準方程為＝０．１４４ 0ｘ－０．０３０ ６，ｒ＝０．９９３ ９。

２）黃酮含量的測定。吸光度（ｙ）與蘆丁濃度（ｘ//ｍｇ/ｍＬ）的標準曲線的標準方程為＝１．３０１ ９ｘ＋０．００１ ７，ｒ＝０．９９９ ９。

３）單寧含量的測定。吸光度（ｙ）與單寧濃度（ｘ//ｍｇ／１００ ｍＬ）的標準曲線的標準方程為＝０．４９７ ５ｘ－０．０２１ ７，ｒ＝０．９９７ ７。

４）檸檬苦素含量的測定。吸光度（ｙ）與檸檬苦素濃度（ｘ//ｍｇ/ｍＬ）的標準曲線的標準方程為＝５．２３５ 0ｘ－０．１０４ ５，ｒ＝０．９９０ ７。

２．２不同溶劑的橘皮提取物對ＤＰＰＨ的清除能力

由圖１可知，不同溶劑的橘皮提取物對ＤＰＰＨ都具有清除作用，清除率與提取物的濃度存在劑量效應(yīng)關(guān)系，當提取物的濃度為０．８0 ｍｇ／ｍＬ時，乙酸乙酯提取物對ＤＰＰＨ的清除率達到９４．２％。由ＩＣ５０計算小軟件可以計算出５種溶劑的橘皮提取物的ＩＣ５０分別為乙酸乙酯０．１０６ ｍｇ／ｍＬ、正丁醇０．１７１ ｍｇ／ｍＬ、氯仿０．３１１ ｍｇ／ｍＬ、去離子水０．５８４ ｍｇ／ｍＬ和石油醚０．８８７ ｍｇ／ｍＬ，可見５種溶劑的橘皮提取物中乙酸乙酯提取物對ＤＰＰＨ的清除能力最強。

２．３不同溶劑的橘皮提取物對亞硝酸鹽的清除能力

由圖２可知，５種溶劑的橘皮提取物對亞硝酸鹽均有一定的清除作用，且清除率與提取物的濃度存在劑量效應(yīng)關(guān)系，當提取物的濃度為０．８0 ｍｇ／ｍＬ時，乙酸乙酯提取物對亞硝酸鹽的清除率達到６４．２％。由ＩＣ５０計算小軟件計算得出５種溶劑的橘皮提取物的ＩＣ５０分別為：乙酸乙酯０．３６６ ｍｇ／ｍＬ、正丁醇０．５３３ ｍｇ／ｍＬ、氯仿１．０２０ ｍｇ／ｍＬ、去離子水１．８１０ ｍｇ／ｍＬ和石油醚４．４１９ ｍｇ／ｍＬ，與清除ＤＰＰＨ的能力表現(xiàn)出相同的特點，５種溶劑的橘皮提取物中乙酸乙酯提取物對亞硝酸鹽的清除能力最強。

２．４不同溶劑的橘皮提取物中有效成分的含量

由表１可知，乙酸乙酯提取物中４種有效成分的含量遠高于其他溶劑提取物中各成分的含量，黃酮含量最高，達４０．４０ ｍｇ／ｇ；不同溶劑的橘皮提取物中黃酮含量均為最高。由ＳＰＳＳ １８．０軟件計算可知，檸檬苦素含量在５種溶劑的橘皮提取物中有極顯著差異，黃酮、總酚的含量也如此；氯仿提取物和石油醚提取物的單寧含量差異不顯著，其他３種提取物單寧含量差異極顯著。

２．５橘皮提取物中有效成分與對ＤＰＰＨ和亞硝酸鹽清除能力的相關(guān)性

橘皮提取物中黃酮、檸檬苦素、總酚和單寧含量與提取物對ＤＰＰＨ和亞硝酸鹽清除能力的相關(guān)性分析結(jié)果如表２所示。由表２可知，黃酮含量與ＤＰＰＨ清除率之間呈顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為０．９３６，與亞硝酸鹽清除率之間呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為０．９６９，所以黃酮含量與提取物對ＤＰＰＨ和亞硝酸鹽的清除能力之間有良好的相關(guān)性。檸檬苦素和總酚的含量與亞硝酸鹽清除率之間也呈顯著正相關(guān)。

３結(jié)論

５種不同極性溶劑的橘皮提取物均具有清除ＤＰＰＨ和亞硝酸鹽的能力，其中乙酸乙酯提取物的清除能力最強，表明橘皮中具有清除ＤＰＰＨ和亞硝酸鹽能力的活性成分主要為中等極性的成分，乙酸乙酯是較為適宜的提取溶劑。

檸檬苦素含量在５種溶劑的橘皮提取物中有極顯著差異，黃酮、總酚的含量也如此；而氯仿提取物和石油醚提取物的單寧含量差異不顯著，其他３種提取物單寧含量差異極顯著。且５種溶劑的橘皮提取物中黃酮的含量均最大，而且黃酮含量與提取物清除ＤＰＰＨ的能力呈顯著正相關(guān)，與提取物清除亞硝酸鹽的能力呈極顯著正相關(guān)，檸檬苦素與總酚的含量與提取物清除亞硝酸鹽的能力呈顯著正相關(guān)，因此推測橘皮的主要抗氧化成分為黃酮，清除亞硝酸鹽的主要活性成分為黃酮、檸檬苦素、總酚等成分。

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