許鍇 張德亭 鄭加永 柳牡丹

[摘要] 目的 通過對(duì)乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及血漿中共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的檢測(cè)，初步探討其外周血檢測(cè)對(duì)乙型肝炎診治的價(jià)值。 方法 將86例確診為乙型肝炎患者根據(jù)病情分為3組，急性乙型肝炎(AHB)、慢性乙型肝炎(CHB)及HBsAg無癥狀攜帶者(ASC)組。采集外周血，分別檢測(cè)ALT、AST、總膽紅素（TBIL）、cccDNA、HBV-DNA。 結(jié)果 三組血漿cccDNA檢測(cè) 結(jié)果有顯著性差異（P＜0.01）。單個(gè)核細(xì)胞cccDNA 7個(gè)標(biāo)本陽性，血漿cccDNA與HBV-DNA、ALT 、AST 、TBIL相關(guān)系數(shù)分別為0.817、0.402、0.450、0.221。 結(jié)論 血漿cccDNA在乙型肝炎患者的各個(gè)病程有顯著性差異，單個(gè)核細(xì)胞cccDNA儲(chǔ)存池確實(shí)存在但濃度較低難以檢測(cè)。血漿cccDNA與HBV-DNA、ALT、AST相關(guān)，但與TBIL無明顯相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 乙型肝炎；HBV-DNA；共價(jià)閉合環(huán)狀DNA

[中圖分類號(hào)] R512.6+2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）02-0064-03

Clinical apply of peripheral blood HBV cccDNA detection

XU Kai1 ZHANG Deting1 ZHENG Jiayong1 LIU Mudan2

1.Wenzhou Third People's Hospital in Zhejiang Province， Wenzhou 325000, China； 2.Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China

[Abstract] ObjectiveTodetectboth peripheral blood mononuclear and plasmacovalently closed circular DNA(cccDNA) of HBV patients, to investigate peripheral blood cccDNA value for HBVdiagnosis and treatment. MethodsDivided86 cases ofHBV patients into three groups, acute hepatitis B (AHB), chronic hepatitis B (CHB), HBsAg asymptomatic carriers (ASC) group. Peripheral blood was collected, we detectedALT, AST, TBIL, cccDNAand HBV-DNA, then analyzed the result with SPSS 11.0. Results With rank sum test, there were significant difference for cccDNA among three groups (P＜0.01). Seven samples was positive for peripheral blood mononuclear, plasma HBV-DNA and cccDNA, ALT, AST, TBIL correlation coefficients were 0.817, 0.402, 0.450, 0.221. The cccDNA in the plasma of all patients with hepatitis B disease were significantly different, mononuclear cells cccDNA storage pool does exist but it's low and difficult to detect. Conclusion Concentration ofplasma cccDNA is related with HBV-DNA, ALT, AST, but no significant correlation with TBIL.

[Key words] Hepatitis B； HBV-DNA；Covalently closed circular DNA

目前臨床主要依靠血清學(xué)方法檢測(cè)HBsAg來診斷乙型肝炎感染情況，同時(shí)通過HBV-DNA的檢測(cè)反映病毒復(fù)制情況或水平，用于患者病情的監(jiān)測(cè)以及抗病毒療效。2008年，吳月平[1]等報(bào)道了乙型肝炎病毒感染的肝細(xì)胞核內(nèi)可檢測(cè)到一種不同形式的病毒DNA-共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，它不與蛋白共價(jià)結(jié)合，是乙肝病毒基因組的復(fù)制中間體，是rcDNA(松弛環(huán)狀DNA)基礎(chǔ)上合成的產(chǎn)物，又是前基因組mRNA合成的模板，它是評(píng)價(jià)HBV感染狀態(tài)及藥物療效最重要的指標(biāo)。目前cccDNA的檢測(cè)多停留于科研階段并未大規(guī)模應(yīng)用于臨床，且目前研究肝細(xì)胞中cccDNA的報(bào)道多見，但外周血特別是單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的報(bào)道較少見。有文獻(xiàn)報(bào)道,乙型肝炎患者PBMC中存在乙型肝炎DNA及病毒復(fù)制中間產(chǎn)物RNA[2] ，但對(duì)于PBMC中是否含有cccDNA、是否有復(fù)制都存在爭(zhēng)議，且臨床意義并不明確[3,4]。本文就86例乙型肝炎患者進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞和血漿中cccDNA的檢測(cè)，探討外周血HBV cccDNA檢測(cè)的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

選取2009年1～9月本院住院的乙型肝炎患者86例，男46例，女40例；年齡16～77歲,平均（43.9±17.0）歲，其中慢性乙型肝炎（CHB）36例、急性乙型肝炎（AHB）20例、HBsAg無癥狀攜帶者（ASC）30例，診斷符合2000年病毒性肝炎防治方案Ⅲ及2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[5]。

1.2 標(biāo)本來源

用真空管采集上述乙型肝炎患者靜脈血5mL，2mL血液用EDTA-K2抗凝，3mL血液不用抗凝。不抗凝血分離血清，用于ALT 、AST 、TBIL檢測(cè)；抗凝血離心分離血漿，用于血漿cccDNA與HBV-DNA檢測(cè)；離心后的血細(xì)胞層加淋巴細(xì)胞分離液，提取單核細(xì)胞進(jìn)行cccDNA檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

ALT、AST和TBIL在OLYMPUS 5400全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定；HBV-DNA的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑購自上?？迫A生物有限公司；血漿cccDNA和單核細(xì)胞cccDNA的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑購自上海申友生物技術(shù)有限公司，在ABI 7500熒光定量PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)。HBV-DNA的抽提使用經(jīng)典的酚氯仿抽提法[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS軟件，對(duì)三組結(jié)果的比較使用秩和檢驗(yàn)，對(duì)于不同指標(biāo)之間的數(shù)據(jù)使用秩相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2．1急性乙型肝炎

急性乙型肝炎20例血漿cccDNA陽性18例，陽性率90%；慢性乙型肝炎36例，cccDNA陽性18例，陽性率50%；HBsAg無癥狀攜帶者組30例，沒有cccDNA陽性病例，陽性率0。三組之間采用秩和檢驗(yàn)，有顯著性差異（P＜0.01）；cccDNA陽性的病例其濃度分布有明顯分別；急性乙型肝炎組濃度明顯高于慢性乙型肝炎（P＜0.01）。

2．2 單個(gè)核細(xì)胞cccDNA的檢測(cè)

單個(gè)核細(xì)胞cccDNA的檢測(cè)只有急性乙型肝炎組有7例陽性，且濃度明顯低于外周血的含量。

2．3 血漿cccDNA與HBV-DNA、ALT、AST、TBIL秩相關(guān)

血漿cccDNA與HBV-DNA、ALT、AST、TBIL秩相關(guān)系數(shù)分別為0.817、0.402、0.450、0.221；乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與HBV-DNA的秩相關(guān)系數(shù) Rs=0.817, P＜0.01，可以認(rèn)為乙型肝炎患者血漿中cccDNA與HBV-DNA水平存在正相關(guān)。乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與AST的秩相關(guān)系數(shù)Rs=0.450, P＜0.01，可以認(rèn)為乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與AST存在正相關(guān)。乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與ALT的秩相關(guān)系數(shù)Rs=0.402, P＜0.01,可以認(rèn)為乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與ALT存在正相關(guān)。乙型肝炎患者血漿中cccDNA水平與TBIL的秩相關(guān)系數(shù)Rs=0.221, Rs＜0.4，根據(jù)相關(guān)系數(shù)重測(cè)信度評(píng)價(jià)，R應(yīng)達(dá)到0.4以上，可認(rèn)為cccDNA水平與TBIL相關(guān)性無意義。

3 討論

乙型肝炎病毒的復(fù)制是一種保守的機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄后模板仍然完整。乙肝DNA的復(fù)制，cccDNA是前基因組mRNA合成的模板，轉(zhuǎn)錄前基因組RNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負(fù)鏈DNA，再合成雙鏈DNA，繼而成熟為cccDNA，是一個(gè)連續(xù)的過程[7]。cccDNA的產(chǎn)生過程相當(dāng)復(fù)雜，目前尚未對(duì)cccDNA的形成有明確的結(jié)論，但cccDNA作為乙肝DNA的復(fù)制模板是感染病程的關(guān)鍵因素，所以乙型肝炎治療的關(guān)鍵因素是清除和抑制cccDNA。cccDNA的檢測(cè)特別是外周血cccDNA在臨床上具有重要作用，但相關(guān)資料不多。由于肝組織標(biāo)本取材限制，直接cccDNA維持和清除機(jī)制進(jìn)行研究受到嚴(yán)重阻礙，到目前為止體內(nèi)cccDNA的濃度、運(yùn)轉(zhuǎn)和清除機(jī)制都還知之甚少。我們可以進(jìn)行假設(shè)，轉(zhuǎn)氨酶等酶類存在于肝細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體中，這些物質(zhì)在肝細(xì)胞損傷時(shí)可以直接釋放入血，同理細(xì)胞核內(nèi)的ccDNA分子在肝細(xì)胞損傷時(shí)也應(yīng)該可以釋放到血液中，而且這種釋放會(huì)隨著肝損程度的增加而增加。對(duì)于同一個(gè)患者而言，在不同時(shí)間段內(nèi)，其cccDNA水平應(yīng)該也相應(yīng)發(fā)生變化，對(duì)判斷病情有意義。目前通過肝活檢來監(jiān)測(cè)乙肝患者肝組織中的cccDNA水平變化存在著一定困難，因而監(jiān)測(cè)外周血中的cccDNA動(dòng)態(tài)變化更具有現(xiàn)實(shí)意義。

本課題對(duì)86例乙型肝炎患者進(jìn)行分組，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)患者血漿中cccDNA。急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、HBsAg無癥狀攜帶者三組之間cccDNA分布位置有差異；86例患者血漿cccDNA水平與ALT、AST存在正相關(guān)，而這兩個(gè)指標(biāo)可以代表肝功能損害。但患者血漿中cccDNA與血漿中TBIL并無相關(guān)性，可能因?yàn)門BIL升高是反應(yīng)重度肝損的指標(biāo)，當(dāng)有大量肝細(xì)胞損傷壞死時(shí)TBIL才會(huì)升高，當(dāng)肝細(xì)胞炎癥和輕度損傷時(shí)其升高并不明顯。因此，血漿檢測(cè)出的cccDNA可以作為肝臟損害的標(biāo)志，可以反映乙肝患者病情進(jìn)展及程度，同時(shí)也反映了實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)乙型肝炎患者血漿中HBV cccDNA靈敏度較高、特異性強(qiáng)，可以應(yīng)用于臨床來監(jiān)測(cè)乙肝患者血漿中cccDNA的水平及動(dòng)態(tài)變化。

PBMC是體內(nèi)免疫活性細(xì)胞的集合體，這些細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。有研究表明[8]，HBV肝外的一個(gè)重要靶細(xì)胞就是PBMC，PBMC在乙肝免疫功能及病毒持續(xù)改變發(fā)揮特定的作用，在患者PBMC中檢測(cè)出cccDNA，說明HBV可以感染PBMC。本文研究發(fā)現(xiàn)在乙型肝炎患者PBMC中cccDNA有7例陽性，占8.3%,說明HBV不但可以感染PBMC，而且可以在其中復(fù)制。但本實(shí)驗(yàn)PBMC中cccDNA檢出率較低，且濃度均較低，與鄭守虎[9]等報(bào)道的60%的陽性比率相差很大，可能為我們實(shí)驗(yàn)分組方式稀釋了陽性比率，且我們本次實(shí)驗(yàn)采用ATP酶降解標(biāo)本中的松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）,大大減少了HBV-DNA對(duì)cccDNA檢測(cè)造成的影響。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了cccDNA復(fù)制的肝外儲(chǔ)存池的存在，可以解釋血漿cccDNA水平與ALT、AST相關(guān)系數(shù)較低的原因：肝細(xì)胞不是外周血cccDNA的唯一來源，PBMC也是外周血中cccDNA的另一來源。PBMC中cccDNA的檢測(cè)可以在乙型肝炎患者抗病毒治療的療效判斷中發(fā)揮重要作用，抗病毒藥物能否殺滅PBMC中的cccDNA也是觀察乙肝復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)存在的問題是: 實(shí)驗(yàn)樣本量較??； cccDNA敏感度低于HBV-DNA；乙型肝炎患者的ALT、AST易受降轉(zhuǎn)氨酶藥物治療等原因的影響等。有待進(jìn)一步增加樣本數(shù)量及動(dòng)態(tài)觀察慢性乙型肝炎患者發(fā)病各期的cccDNA水平，以確定其水平與乙肝患者病情輕重、病情進(jìn)展的關(guān)系。

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（收稿日期：2011-01-11）