郭曉紅 洪艷華 韓文革 鄭桂萍 呂艷東

摘要：對剛毛檉柳（Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ）的過氧化物酶基因（ＴｈＰＯＤ）全長序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因全長為１ ３７６ ｂｐ，包含一個(gè)１ ０８６ ｂｐ的開放閱讀框，可編碼３６１個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子質(zhì)量為３９．３ ｋｕ。根據(jù)ＴｈＰＯＤ基因保守序列設(shè)計(jì)特異引物克隆該基因，并成功構(gòu)建了ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ植物過表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化山新楊（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ × Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ），經(jīng)ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ鑒定，初步證明外源基因ＴｈＰＯＤ已整合到山新楊的基因組中并在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行了表達(dá)。

關(guān)鍵詞：檉柳（Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ）；過氧化物酶基因（ＴｈＰＯＤ）；山新楊（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ × Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ）；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：Ｓ７９３．５；Ｑ５５４＋．６文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）03－0615-05

Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Iｎｔｏ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ ×Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ

ＧＵＯ Ｘｉａｏ－ｈｏｎｇ，ＨＯＮＧ Ｙａｎ－ｈｕａ，ＨＡＮ Ｗｅｎ－ｇｅ，ＺＨＥＮＧ Ｇｕｉ－ｐｉｎｇ，Ｌ?譈 Ｙａｎ－ｄｏｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｂａｙｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ １６３３１９，Ｈｅiｌｏｎｇｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＴｈＰＯＤ ｇｅｎｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ ｒｏｏｔ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＴｈＰＯＤ ｗａｓ １ ３７６ ｋｂ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ １ ０８６ ｂｐ ＯＲＦ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ＴｈＰＯＤ ｗａｓ ３９．３ ｋｕ ｗｉｔｈ ３６１ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＴｈＰＯＤ． Ｐｌａｎｔ ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓion ｖｅｃｔｏｒ ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ； Aｎｄ ｔｈｅ ＴｈＰＯＤ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ × Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ＰＣＲ ａｎｄ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＴｈＰＯＤ ｗａｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ； ＴｈＰＯＤ； Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ × Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ； ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ

過氧化物酶（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＰＯＤ，ＥＣ１．１１．１．７）是廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的一類氧化還原類酶，主要與過氧化氫的清除有關(guān)［１］。該酶參與眾多的植物生理過程，在植物的生長發(fā)育、抵御生物和非生物脅迫方面起著一定作用［２－６］。目前，已對模式植物如擬南芥、水稻、煙草等的過氧化物酶的基因序列、表達(dá)模式、酶學(xué)性質(zhì)及生理功能等方面進(jìn)行了研究［７－９］，但在木本植物中鮮有報(bào)道。

剛毛檉柳（Ｔａｍａｒｉｘ ｈｉｓｐｉｄａ）屬檉柳科檉柳屬，廣泛分布于礫石戈壁、粘土、沙土、流沙及各種不同程度的鹽漬化土壤，具有抗旱、耐鹽堿、耐沙埋、耐貧瘠的特點(diǎn)，是荒漠地區(qū)鹽漬化沙地上良好的固沙造林樹種，也是進(jìn)行植物抗干旱和耐鹽堿基因克隆的理想材料之一。ＴｈＰＯＤ是從ＮａＣｌ脅迫條件下剛毛檉柳根的ｃＤＮＡ文庫中分離到的編碼過氧化物酶的基因，屬于植物過氧化物酶基因家族成員之一，能夠被干旱、鹽和冷及重金屬（ＣｄＣｌ２）等非生物脅迫因子所誘導(dǎo)，且能保護(hù)大腸桿菌細(xì)胞免于非生物脅迫［１０－１２］。本研究對前期研究獲得的ＴｈＰＯＤ序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并利用農(nóng)桿菌葉盤法將該基因轉(zhuǎn)入山新楊（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｄａｖｉｄｉａｎａ × Ｐ． ｂｏｌｌｅａｎａ），以期為進(jìn)一步研究過氧化物酶在植物對逆境的響應(yīng)等的分子調(diào)控機(jī)理以及利用基因工程技術(shù)改良林木品種奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料和試劑

根癌農(nóng)桿菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５、大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９菌株為東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；植物表達(dá)載體ｐＲＯＫⅡ由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)張慧教授惠贈(zèng)；ｐＭＤ１８Ｔ－ ＴｈＰＯＤ質(zhì)粒、ｐＥＴ３２ａ－ＴｈＰＯＤ質(zhì)粒由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室姜靜教授惠贈(zèng)；限制性內(nèi)切酶ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ、Ｅｘ Ｔａｑ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ等購自ＭＢＩ，質(zhì)粒（小量）提取試劑盒、膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２０００購自寶生物工程（大連）有限公司?？敲顾兀ǎ耍幔睿幔恚悖椋?Ｓｕｌｆａｔｅ，Ｋｍ）購自Ｓｉｇｍａ公司，其他化學(xué)試劑等購自國內(nèi)生產(chǎn)廠家，均為分析純。

１．２方法

１．２．１ＴｈＰＯＤ序列生物信息學(xué)分析用ＮＣＢＩ的ＯＲＦ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ）軟件尋找ＴｈＰＯＤ的開放閱讀框；采用ＥｘＰＡＳｙ的ＰｒｏｔＰａｒａｍ Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ）分析ＴｈＰＯＤ的理化性質(zhì)；用Ｐｒｏｓｉｔｅ軟件（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏ－ｓｉｔｅ）預(yù)測編碼蛋白的特定功能位點(diǎn)；Ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ預(yù)測ＴｈＰＯＤ氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ）；用Ｓｉｇｎａｌ Ｐ ３．０ Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ｓｉｇｎａｌ Ｐ）進(jìn)行蛋白質(zhì)序列中信號肽的預(yù)測分析。

１．２．２ＴｈＰＯＤ基因的分離根據(jù)已獲得的ＴｈＰＯＤ基因保守序列，利用Ｏｌｉｇｏ６．０軟件設(shè)計(jì)一對ＰＣＲ特異擴(kuò)增引物擴(kuò)增ＴｈＰＯＤ的開放閱讀框，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。上下游引物序列分別為：上游引物５′－ＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡ

ＴＣＡＧＣＡＧＴ－３′，下游引物５′－ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴＡＴＴＣ

ＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＴＡＣ－３′（劃線部分分別為Ｂａｍ ＨⅠ和ＳａｃⅠ的酶切位點(diǎn)）。ＰＣＲ反應(yīng)體系為２０ μＬ，包括１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ、２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１０ Ｕ／μＬ ＥｘＴａｑ、上下游引物各５ ｍｏｌ／Ｌ、模板ｐＭＤ１８Ｔ－ＴｈＰＯＤ ６０ ｎｇ。ＰＣＲ擴(kuò)增條件為：９４ ℃預(yù)變性３ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，５６ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸６０ ｓ，３０個(gè)循環(huán)；７２ ℃，７ ｍｉｎ。

１．２．３植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定質(zhì)粒ｐＭＤ１８Ｔ－ＴｈＰＯＤ經(jīng)限制性內(nèi)切酶ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ消化后回收小片段，植物表達(dá)載體ｐＲＯＫⅡ經(jīng)ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ消化后回收大片段，將兩個(gè)片段經(jīng)Ｔ４連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ＪＭ１０９感受態(tài)細(xì)胞，在含５０ ｍｇ／Ｌ Ｋｍ的ＬＢ平板上篩選陽性菌落，堿裂解法提取質(zhì)粒，利用ＰＣＲ、酶切及測序進(jìn)一步確認(rèn)目的片段是否連接到ｐＲＯＫⅡ載體上。將ＰＣＲ擴(kuò)增、酶切鑒定均為陽性及測序正確的質(zhì)粒命名為ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ。重組質(zhì)粒ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ通過電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５感受態(tài)細(xì)胞，在含有５０ ｍｇ／Ｌ Ｒｉｆ和５０ ｍｇ／Ｌ Ｋｍ的ＹＥＢ平板上篩選陽性克隆，使用堿裂解法提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。

１．２．４農(nóng)桿菌介導(dǎo)的山新楊遺傳轉(zhuǎn)化菌種的活化和工程菌液的制備按文獻(xiàn)［１３］所述方法進(jìn)行，參照文獻(xiàn)［１４，１５］的方法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。

１．２．５轉(zhuǎn)基因山新楊植株的檢測①ＤＮＡ提取及ＰＣＲ的檢測。取轉(zhuǎn)化的山新楊植株幼嫩葉片，ＣＴＡＢ法提取總ＤＮＡ。１０ μＬ ＰＣＲ反應(yīng)體系包括：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １．０ μＬ，ＭｇＣｌ２ ０．６ μＬ，上下游引物（５ ｍｍｏＬ／Ｌ）各１．０ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏＬ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｅｘ Ｔａｑ（１０ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ，模板ＤＮＡ（５０ ｎｇ）１．０ μＬ。ＰＣＲ反應(yīng)程序?yàn)椋海梗?℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性４０ ｓ，５６ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０個(gè)循環(huán)；７２ ℃保溫７ ｍｉｎ。ＰＣＲ 產(chǎn)物用１．５％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ質(zhì)粒為陽性對照，以未經(jīng)轉(zhuǎn)化的山新楊植株試管苗總ＤＮＡ為陰性對照，同時(shí)設(shè)純水對照，對轉(zhuǎn)化再生植株進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增檢測。②Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印跡雜交檢測。采用ＳＤＳ法［１６］提取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ丈叫聴畹目偅遥危?，在０．８％的甲醛變性膠上進(jìn)行電泳，采用虹吸法將ＲＮＡ轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，按標(biāo)準(zhǔn)的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印跡法進(jìn)行雜交和檢測［１７］。

２結(jié)果與分析

２．１檉柳ＴｈＰＯＤ基因生物信息學(xué)分析

２．１．１ｃＤＮＡ及氨基酸序列分析ＴｈＰＯＤ全長為１ ３７６ ｂｐ，其中５端非翻譯區(qū)１６３ ｂｐ，３端非翻譯區(qū)９６ ｂｐ，１ ３４７－１ ３７6位為Ｐｏｌｙ（Ａ）尾（圖1）。開放閱讀框編碼由３６１個(gè)氨基酸殘基組成的多肽。氨基酸序列的分子量為３９．３ ｋｕ，理論等電點(diǎn)為６．５９。編碼的蛋白為酸性蛋白質(zhì)。負(fù)電荷殘基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）數(shù)為３５，正電荷殘基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）數(shù)為３４個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為３７．１７，為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

２．１．２ＴｈＰＯＤ二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析用ＳＯＰＭＡ預(yù)測ＴｈＰＯＤ氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)（圖2），α－螺旋和不規(guī)則卷曲是ＴｈＰＯＤ主要的結(jié)構(gòu)元件，而β－轉(zhuǎn)角和延伸鏈則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。統(tǒng)計(jì)表明，ＴｈＰＯＤ的二級結(jié)構(gòu)由３９．６１％的α－螺旋、３９．３４％的不規(guī)則卷曲、１６．０７％的延伸鏈和４．９９％的β－轉(zhuǎn)角組成。與豇豆、菠菜、煙草、大戟屬和擬南芥ＰＯＤ的二級結(jié)構(gòu)相同，這說明ＰＯＤ的二級結(jié)構(gòu)是高度保守的，與劉穩(wěn)等［１８］報(bào)道的結(jié)果一致。

２．１．３其他預(yù)測結(jié)果ＳＭＡＲＴ和ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ分析結(jié)果表明，ＴｈＰＯＤ還具有過氧化物酶超家族的其他特征基序，如４個(gè)保守的二硫化物橋（５１－１３２，８４－８９，１３８－３３３，２１８－２４５）和２個(gè)保守的鈣綁定位點(diǎn)（２１２，２６５）。除此之外，該基因包含４個(gè)Ｎ－糖基化位點(diǎn)（１１０－１１３，ＮＬＴＬ；１８６－１８９，ＮＡＴＴ；２５２－２５５，ＮＴＴＶ；３０１－３０４：ＮＱＳＬ），４個(gè)蛋白激酶Ｃ磷酸化位點(diǎn)（１１２－１１４，ＴLＲ； ２３３－２３５，ＴDＫ； ２９０－２９２，ＴTＫ； ３４０－３４２，ＳFＫ），６個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（１３７－１４０，ＳCAＤ； ２５４－２５７， ＴVLＤ； ２８０－２８３， ＴSDＥ； ２８１－２８４，ＳDEＤ； ３２５－３２８，ＴQQＥ； ３４５－３４８，ＳVVＤ），２個(gè)氨基化位點(diǎn)（１６２－１６５，LＧＲＲ；３５５－３５８，YＧＲＲ），一個(gè)依賴于ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（１６４－１６７，ＲＲDＳ）和５個(gè)肉豆蔻?；稽c(diǎn)（４１－４６，ＧＬSWＳＦ；７１－７６，ＧＱAAＧＬ；８８－９３，ＧＣDGＳＶ；２１９－２２４，ＧＳFTＮＷ；２７７－２８２，ＧＬFTＳＤ）。此外，該基因所編碼的蛋白為分泌型蛋白且有信號肽。

２．２ＴｈＰＯＤ基因開放閱讀框的獲得

以質(zhì)粒ｐＭＤ１８Ｔ－ＴｈＰＯＤ為模板，用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行ＰＣＲ，擴(kuò)增出長約１ ０８６ ｂｐ的ＤＮＡ片段（圖3），與預(yù)期的片段長度相符，陰性對照沒有擴(kuò)增出條帶，初步確定獲得的片段為ＴｈＰＯＤ基因的開放閱讀框。

２．３ＴｈＰＯＤ基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

ＰＣＲ產(chǎn)物及ｐＲＯＫⅡ載體經(jīng)ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ進(jìn)行雙酶切后，連接并轉(zhuǎn)化Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９，在含有５０ μｇ／ｍＬ Ｋｍ的平板上挑取陽性菌落，ＬＢ液體培養(yǎng)基培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，利用特異引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果與以ｐＭＤ１８Ｔ－ＴｈＰＯＤ質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到的片段大小一致（圖略）；同時(shí)利用ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，結(jié)果顯示在１ ０８６ ｂｐ處有一特異片段（圖４），表明目的片段已成功地插入表達(dá)載體。經(jīng)序列測定證實(shí)插入片段為ＴｈＰＯＤ開放閱讀框序列，且序列完全、正確。

２．４農(nóng)桿菌介導(dǎo)的山新楊遺傳轉(zhuǎn)化

采用電轉(zhuǎn)化法將ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ載體直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５，用ＴｈＰＯＤ基因的特異引物ＰＣＲ擴(kuò)增鑒定農(nóng)桿菌質(zhì)粒中目的基因的存在。從圖５可知農(nóng)桿菌質(zhì)粒與大腸桿菌質(zhì)粒ＰＣＲ結(jié)果相一致，說明植物表達(dá)載體ｐＲＯＫⅡ－ＴｈＰＯＤ已轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。經(jīng)愈傷誘導(dǎo)、共培養(yǎng)、篩選、預(yù)分化、分化得到１７株轉(zhuǎn)基因山新楊苗。

２．５轉(zhuǎn)基因山新楊的檢測

用ＣＴＡＢ法提取１７株轉(zhuǎn)基因植株及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑幕蚪MＤＮＡ，以此為模板，用ＴｈＰＯＤ基因開放閱讀框的特異引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，檢測ＴｈＰＯＤ是否整合到了山新楊基因組中。以非轉(zhuǎn)化植株和純水做陰性對照，所得瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖６。從圖６可以看出，１７個(gè)卡那霉素抗性植株中有１４株可以擴(kuò)增出目的條帶，而非轉(zhuǎn)化植株和純水陰性對照中均沒有擴(kuò)增出產(chǎn)物，結(jié)果初步證明已獲得１４株含外源ＴｈＰＯＤ基因的山新楊轉(zhuǎn)化植株，將其分別命名為ＴＬ１－ＴＬ１４。

為檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，以非轉(zhuǎn)基因山新楊植株為陰性對照，對陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。采用ＣＴＡＢ法提取轉(zhuǎn)基因（ＴＬ１，ＴＬ３，ＴＬ５，ＴＬ８，ＴＬ１２）和非轉(zhuǎn)基因山新楊葉片總ＲＮＡ，用ＤＮａｓｅⅠ消化后經(jīng)凝膠電泳檢測符合實(shí)驗(yàn)要求（圖７）。采用ＤＩＧ標(biāo)記的ＴｈＰＯＤ的特異性探針進(jìn)行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ，結(jié)果表明檉柳ＴｈＰＯＤ在轉(zhuǎn)基因山新楊植株的葉片中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄，非轉(zhuǎn)基因植株未出現(xiàn)雜交信號。

３結(jié)論與討論

過氧化物酶目前已在棉花［１９］、小麥［２０］、甘薯［２１］、針葉樹［２２］等植物中分離。在高等植物中，過氧化物酶是被多基因家族編碼的，過氧化物酶超家族的所有成員均參與以過氧化氫作為電子受體的多步氧化反應(yīng)，該類酶主要存在于植物的細(xì)胞外和液泡膜空間，參與過氧化氫的脫毒、植物激素代謝、木質(zhì)素的生物合成和脅迫反應(yīng)［１］。研究表明ＴｈＰＯＤ響應(yīng)于鹽、冷、干旱、重金屬脅迫及ＡＢＡ處理，與植物抗逆性的調(diào)控相關(guān)。因此可以推斷ＴｈＰＯＤ是一個(gè)與逆境脅迫相關(guān)的基因［１１，１２］。生物信息學(xué)分析表明，ＴｈＰＯＤ基因具有過氧化物酶超家族的特征基序，其二級結(jié)構(gòu)也是高度保守的。

對過氧化物酶基因進(jìn)行基因工程研究已經(jīng)取得了一定的成果。Ｋｉｍ等［２３］通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將甜薯過氧化物酶基因（ｓｗｐａ４）轉(zhuǎn)入煙草植株中，轉(zhuǎn)基因植株過氧化物酶活性是對照植株酶活的５０倍，該基因的過表達(dá)能夠提高煙草對鹽脅迫、氧化脅迫以及干旱脅迫的耐性，并推測該基因在過氧化氫調(diào)控的脅迫響應(yīng)信號通路中可能起到一個(gè)有利的防御信號的作用。可見采用基因工程手段，通過過量表達(dá)可清除活性氧自由基的抗氧化解毒酶，可以提高植物抗氧化脅迫的能力，繼而提高植物耐性。本研究將克隆獲得的ＴｈＰＯＤ基因開放閱讀框構(gòu)建到植物表達(dá)載體ｐＲＯＫⅡ中ＣａＭＶ３５Ｓ啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建了ＴｈＰＯＤ基因過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化山新楊，共獲得１７個(gè)卡那霉素抗性植株，ＰＣＲ檢測結(jié)果顯示其中１４個(gè)轉(zhuǎn)化植株為陽性，從中選?。祩€(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ鑒定，結(jié)果證實(shí)ＴｈＰＯＤ基因已經(jīng)整合到山新楊基因組中并能夠轉(zhuǎn)錄出ｍＲＮＡ。本研究為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能，并深入了解過氧化物酶在植物對逆境的響應(yīng)等方面的分子調(diào)控機(jī)理以及利用基因工程技術(shù)改良林木品種奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯向闈）

收稿日期：２０１１－０８－１２

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目（１１５５１３１８）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)博士啟動(dòng)基金（Ｂ２０１０－５）

作者簡介：郭曉紅（１９８０－），女，黑龍江寧安人，講師，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究，（電子信箱）ｄｏｎｇｊｉｎｇｃｈｅｎｇ２００２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；

通訊作者，呂艷東，副研究員，博士，主要從事植物基因工程及水稻節(jié)水灌溉研究，（電子信箱）ｌｕｙａｎｄｏｎｇ３３６＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ。