張卓睿等

摘要：以ＮＫＡ樹(shù)脂為吸附劑，對(duì)酸櫻桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）中原花青素的分離純化進(jìn)行了研究。通過(guò)單因素試驗(yàn)分析確定了原花青素分離純化的最佳工藝條件為，上樣濃度７ ｍｇ／Ｌ，上樣流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，用體積分?jǐn)?shù)為９５％的乙醇溶液作為洗脫劑，以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ流速進(jìn)行洗脫。經(jīng)樹(shù)脂純化后的原花青素通過(guò)ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析確定其主要含兩種組分，分別為原花青素－３－葡萄糖苷和（－）－表兒茶素沒(méi)食子酸酯。

關(guān)鍵詞：酸櫻桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）；原花青素；ＮＫＡ樹(shù)脂；分離；純化

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｑ９４９．７５１．８；ＴＱ９１４．１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）04－0800-04

酸櫻桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）屬薔薇科李屬（Ｐｒｕｎｕｓ Ｌ．）經(jīng)濟(jì)樹(shù)木，其果實(shí)中含有豐富的原花青素［１－３］。原花青素（Ｐｒｏｃｙｎｉｄｉｎｓ，簡(jiǎn)稱(chēng)ＰＣ）是一大類(lèi)多酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)，是由兒茶素、表兒茶素及表兒茶素沒(méi)食子酸酯通過(guò)Ｃ４－Ｃ６或Ｃ４－Ｃ８連接而成的不同聚合度的混合物［４］。

原花青素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，以及明顯地抑菌、消炎、抗癌、抗老化和抑制膽固醇上升等功效，攝取一定量原花青素能夠有效地預(yù)防和抑制疾病的發(fā)生［５－９］。目前，原花青素已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、制革和日用化工等相關(guān)領(lǐng)域，并發(fā)揮著不可替代的作用，隨著天然產(chǎn)物生產(chǎn)加工的逐漸興起，原花青素更成為天然產(chǎn)物和有機(jī)化學(xué)的研究熱點(diǎn)［１０－１３］。不過(guò)，對(duì)于酸櫻桃果實(shí)中原花青素的開(kāi)發(fā)利用，目前國(guó)內(nèi)尚處于起步階段，還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此，從酸櫻桃果實(shí)中提取原花青素并進(jìn)行分離純化的研究具有較大的開(kāi)發(fā)潛力和實(shí)用價(jià)值。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料與試劑酸櫻桃：吉林市九站試驗(yàn)基地提供；ＮＫＡ樹(shù)脂：南開(kāi)大學(xué)化工廠(chǎng)生產(chǎn)；無(wú)水乙醇、甲醇、甲酸、石油醚、乙酸乙酯均為分析純。

１．１．２主要儀器與設(shè)備循環(huán)水式多用真空泵（ＳＨＢ－Ｂ９５）：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；恒溫水浴鍋（Ｂ－２６０）：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（ＲＥ５２ＣＳ－１）：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；真空冷凍干燥機(jī)（ＦＤ）：北京博醫(yī)康儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（ＳＣＲ２０ＢＣ）：日本日立公司；電子分析天平（ＡＢ２０４－Ｎ）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ＵＶ－２５０１ ＰＣ型分光光度計(jì)：日本島津公司；Ｗａｔｅｒｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＺＭＤ４０００液質(zhì)聯(lián)用儀；Ｗａｔｅｒｓ ２６９０液相色譜儀（包括梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器等）；Ｗａｔｅｒｓ ９６６二極管陣列檢測(cè)器。

１．２方法

１．２．１原花青素的測(cè)定方法采用鹽酸－香草醛法［１４］。

１．２．２原花青素提取液的制備方法酸櫻桃經(jīng)清洗、去核后，用膠體磨處理１５ ｍｉｎ，按溶劑與物料質(zhì)量比１∶４加入體積分?jǐn)?shù)為７０％的乙醇，在６０ ℃下冷凝回流提?。泊?，每次４ ｈ。合并兩次提取液，冷凍干燥后得原花青素提取液。

１．２．３原花青素萃取分離的方法提取液中的脂類(lèi)等雜質(zhì)不利于純化分析，因此，須對(duì)提取液進(jìn)行萃取分離。①脫脂：向提取液中加入３倍體積的石油醚，混勻，在分液漏斗中靜置至分層，放出下層溶液，所放出溶液再重復(fù)一遍脫脂操作；②萃取分離：向脫脂后的提取液中加入２倍體積的乙酸乙酯，混勻后在分液漏斗中靜置至分層，除去下層溶液保留上層溶液，將上層溶液重復(fù)此操作３次，最后蒸餾濃縮除去乙酸乙酯，得到原花青素萃取液。

１．２．４NKA樹(shù)脂吸附的方法

１）NKA樹(shù)脂的預(yù)處理。將NKA樹(shù)脂在無(wú)水乙醇中浸泡２４ ｈ，除去樹(shù)脂中雜質(zhì)，然后濕法裝柱。裝好后，用去離子水以２.0 ｍＬ／ｍｉｎ的流速?zèng)_洗樹(shù)脂柱，直到無(wú)乙醇?xì)埩?；以同樣的流速，將０．０?ｇ／Ｌ的ＨＣｌ通過(guò)樹(shù)脂柱，２ ｈ后再以去離子水洗至中性，接著以２.0 ｍＬ／ｍｉｎ的流速，將０．０５ ｇ／Ｌ的ＮａＯＨ水溶液通過(guò)樹(shù)脂柱，２ ｈ后再以去離子水洗至其洗出液至中性，備用。

２）最佳上樣流速的確定。稱(chēng)取３份已處理好的樹(shù)脂各２ ｇ，分別以流速０．５、１．０、２．０ ｍＬ／ｍｉｎ通入原花青素萃取液，每間隔２ ｍＬ測(cè)定流出液吸光值，根據(jù)結(jié)果確定最佳上樣流速。

３）最佳上樣濃度的確定。將等量原花青素萃取液稀釋成不同濃度，然后以最佳上樣流速分別通入樹(shù)脂柱。通過(guò)比較吸附前后其吸光值的變化，利用（Ａ０－Ａ１）／Ａ０×１００％計(jì)算出吸附率，其中Ａ０為上樣液的吸光值，Ａ１為樣品全部通過(guò)樹(shù)脂柱后流出液的吸光值。

４）最佳洗脫流速的確定。稱(chēng)取２份已處理好的樹(shù)脂各２ ｇ，分別以最佳上樣流速通入原花青素萃取液１０ ｍＬ，進(jìn)樣完畢后，依次用體積分?jǐn)?shù)為５０％的乙醇溶液以１.0、２.0 ｍＬ／ｍｉｎ洗脫，每間隔２ ｍＬ測(cè)定洗脫液的吸光值，直至洗出液為無(wú)色時(shí)為止，根據(jù)結(jié)果確定最佳洗脫流速。

５）最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定。稱(chēng)?。捣菀烟幚砗玫臉?shù)脂各２ ｇ，分別以最佳上樣流速通入原花青素萃取液１０ ｍＬ，進(jìn)樣完畢后，按照最佳洗脫流速，依次用去離子水、體積分?jǐn)?shù)為３５％、５５％、７５％、９５％的乙醇溶液洗脫，至洗出液為無(wú)色時(shí)為止，測(cè)定洗脫液的吸光值，確定最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

１．２．５純化后原花青素的ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析法樹(shù)脂流出的洗脫液在４０℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，之后在－６０℃條件下冷凍干燥，得到暗紅色油狀物（該物質(zhì)溶于甲醇），再經(jīng)０．４５μｍ膜過(guò)濾后用ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析。

色譜條件：色譜柱Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ（５ μｍ，４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ）；流動(dòng)相Ａ.甲酸－水（甲酸∶水＝１∶９９，Ｖ／Ｖ），Ｂ.甲醇－甲酸－水（甲醇∶甲酸∶水＝８０∶１∶１９，Ｖ／Ｖ／Ｖ）；按小于５ ｍｉｎ、１００％（Ｖ／Ｖ）Ａ，５～５０ｍｉｎ、２０％（Ｖ／Ｖ）Ａ＋８０％（Ｖ／Ｖ）Ｂ，流速１.0 ｍＬ／ｍｉｎ進(jìn)行梯度洗脫。柱溫３０ ℃，進(jìn)樣量２０ μＬ，檢測(cè)分流比５∶１。

質(zhì)譜條件：掃描方式——負(fù)離子掃描（ＥＳＩ，ｍ／ｚ ２６０～１ ５００），毛細(xì)管電壓４．２ ｋＶ，錐孔電壓５０ Ｖ，光電倍增器電壓６５０ Ｖ，離子源溫度１２０ ℃，脫溶劑氣溫度３００ ℃。

２結(jié)果與分析

２．１ＮＫＡ樹(shù)脂的分離與純化

２．１．１最佳上樣流速的確定根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以流出液的體積對(duì)應(yīng)流出液的吸光值作圖，得到不同上樣流速下的吸附曲線(xiàn)，如圖１所示。由圖１可見(jiàn)，上樣流速為２．０ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)，流出液在３ ｍＬ后吸光值即開(kāi)始急劇增加，泄露點(diǎn)出現(xiàn)過(guò)早，所以樣品中的原花青素未能及時(shí)擴(kuò)散到樹(shù)脂內(nèi)部和樹(shù)脂達(dá)到吸附平衡就流出，吸附量較少；上樣流速為０．５ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)，流出液在７ ｍＬ后才出現(xiàn)泄露點(diǎn)，原花青素有充分的時(shí)間進(jìn)入樹(shù)脂內(nèi)部而被吸附分配，吸附性較好，但流速慢，吸附時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；而上樣流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)的吸附曲線(xiàn)與０．５ ｍＬ／ｍｉｎ的非常接近，說(shuō)明二者的吸附效果相差不大。因此綜合考慮，本研究選擇１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的上樣流速，既有較高的吸附性又可提高分析效率。

２．１．２最佳上樣濃度的確定上樣濃度對(duì)NKA樹(shù)脂吸附效果的影響見(jiàn)圖２所示。由圖２可見(jiàn)，隨著上樣濃度的增加，吸附率先升高后降低。在上樣濃度為７ ｍｇ／ｍＬ時(shí)，吸附率最高；之后，隨著上樣濃度的增加，吸附率反而下降，其原因可能是由于當(dāng)上樣濃度過(guò)大時(shí)，會(huì)發(fā)生多層吸附，而且易堵塞樹(shù)脂，影響吸附效率。因此，確定最佳上樣濃度為７ ｍｇ／ｍＬ。

２．１．３最佳洗脫流速的確定根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以洗脫液體積對(duì)應(yīng)洗脫液的吸光值作圖，得到不同洗脫流速下的洗脫曲線(xiàn)，如圖３所示。從圖３可以看出，洗脫流速越低，吸附樹(shù)脂和洗脫劑之間接觸時(shí)間越長(zhǎng)，相互作用越充分，能較好地將原花青素從NKA樹(shù)脂中解吸出來(lái)，洗脫流速越高，洗脫時(shí)的脫尾現(xiàn)象越明顯，洗脫相同量的原花青素所需的洗脫劑越多。當(dāng)洗脫流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)，洗脫高峰比較集中，洗脫劑用量少，脫尾現(xiàn)象不明顯，且較好地解吸了被樹(shù)脂吸附的原花青素。因此本研究選擇１．０ ｍＬ／ｍｉｎ作為洗脫流速。

２．１．４最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定根據(jù)測(cè)定結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)洗脫液吸光值作圖，得到如圖４所示的曲線(xiàn)。由圖４可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，洗脫液吸光值不斷增大，說(shuō)明解吸率不斷增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到９５％時(shí)，解吸效果最好，所以本研究中采用體積分?jǐn)?shù)為９５％的乙醇溶液進(jìn)行洗脫。

２．２純化后原花青素的ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析

經(jīng)ＮＫＡ樹(shù)脂純化后的原花青素通過(guò)ＨＰＬＣ分析，得到了如圖５Ａ所示的色譜圖。由圖可見(jiàn)，純化物中主要含有兩種單體組分Ｍ１和Ｍ２（其保留時(shí)間分別為１２．８２８、１４．９７３ ｍｉｎ），其對(duì)應(yīng)的ＥＳＩ-MS質(zhì)譜圖如圖５Ｂ、５Ｃ所示。

從圖５Ｂ可知，組分Ｍ１的分子離子峰為４５３．１（Ｍ＋１），確認(rèn)該化合物的分子量為４５２，與原花青素－３－葡萄糖苷分子量一致，因此推斷組分Ｍ１為原花青素－３－葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)如圖６。

從圖５Ｃ可知，組分Ｍ２的質(zhì)譜圖中含有（－）－表兒茶素沒(méi)食子酸酯的分子離子峰４４１．２（Ｍ＋１）、失去沒(méi)食子?；纬傻碾x子峰２８９．３和其他一些碎片離子信息，因此推斷組分Ｍ２為（－）－表兒茶素沒(méi)食子酸酯，其結(jié)構(gòu)如圖７。

３結(jié)論與討論

ＮＫＡ樹(shù)脂對(duì)原花青素具有較好的吸附和解吸能力，是分離酸櫻桃中原花青素較理想的吸附劑。經(jīng)試驗(yàn)分析，得到以下結(jié)論。

１）上樣流速為０．５ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)吸附性最好，但分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，而１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的上樣流速與其吸附效果相差不大，因此，本研究選擇１．０ ｍＬ／ｍｉｎ為上樣流速，既有較高的吸附性又可提高分析效率。

２）上樣濃度越大，樹(shù)脂吸附量越多，吸附率越高，但如上樣濃度過(guò)高，又可能導(dǎo)致多層吸附，且易堵塞樹(shù)脂，影響吸附效率。根據(jù)吸附曲線(xiàn)，確定最佳上樣濃度為７ ｍｇ／ｍＬ。

３）洗脫流速越低，吸附樹(shù)脂和洗脫劑之間接觸時(shí)間越長(zhǎng)，相互作用越充分，能較好地將原花青素從NKA樹(shù)脂中解吸出來(lái)，洗脫流速越高，洗脫時(shí)的脫尾現(xiàn)象越明顯，洗脫相同量的原花青素所需的洗脫劑越多。所以選擇１．０ ｍＬ／ｍｉｎ流速作為洗脫流 速。

４）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素的解吸效果有也較大的影響，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為９５％時(shí)解吸效果最好，所以本研究中采用體積分?jǐn)?shù)為９５％的乙醇溶液進(jìn)行洗脫。

５）分離、純化后的原花青素經(jīng)ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析，確定其主要含兩種組分，分別為（－）－表兒茶素沒(méi)食子酸酯和原花青素－３－葡萄糖苷。

通過(guò)試驗(yàn)分析，確定了樹(shù)脂分離、純化酸櫻桃中原花青素的最佳工藝條件，并利用ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ定性了純化物的主要成分，為酸櫻桃中原花青素的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 崔新穎． 酸櫻桃果實(shí)有效藥理成分及藥理作用的研究［Ｊ］． 北華大學(xué)學(xué)報(bào)，２００７，８（４）：１４５－１４９．

［２］ 楊振國(guó)，孟慶繁，唐曉杰，等． 酸櫻桃組織培養(yǎng)中試管苗玻璃化的發(fā)生與防止［Ｊ］． 經(jīng)濟(jì)林研究，２００４，22（2）：47-48．

［３］ ＢＵＲＫＨＡＮＤ Ｔ Ｓ，ＴＡＮ Ｄ Ｘ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｍｅｌａｔｏｎｉｎ ｉｎ ｍｏｎｔｍｏｒｅｎｃｙ ａｎｄ ｂａｌａｔｏｎ ｔａｒｔ ｃｈｅｒｒｉｅｓ［Ｊ］． Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００１，４９（１０）：４８９８－４９０２．

［４］ 張小軍，夏春鏜，吳建銘，等． 原花青素的資源研究［Ｊ］． 中藥材，２００９，３２（６）：１１５４－１１５８．

［５］ 鄭光耀． 葡萄籽原花青素提取物的生理活性、藥理作用及其應(yīng)用［Ｊ］． 林產(chǎn)化工通訊，２０００，３４（１）：２８－３３．

［６］ 趙萬(wàn)洲，陸茵，閆新琦，等． 葡萄籽原花青素抗促癌作用的實(shí)驗(yàn)研究［Ｊ］． 中草藥，２０００，３１（１２）：９１７－９２０．

［７］ 孫麗華，江月仙． 天然抗氧化劑原花青素的保健功能及其應(yīng)用［Ｊ］． 食品研究與開(kāi)發(fā)，２００４，２５（２）：１０９－１１２．

［８］ 何佳聲，黃學(xué)鋒． 原花青素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞ＳＷ６２０增殖和凋亡的影響［Ｊ］． 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，２０１０，１６（４）：４３９－４４２．

［９］ 高峰，張琨，宋昕恬，等． 葡萄籽提取物抗氧化作用人體實(shí)驗(yàn)研究［Ｊ］． 中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué)，２０１０，９（２）：９９－１００．

［１０］ 玉清，謝筆均． 原花青素在化妝品領(lǐng)域的研究與開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀［Ｊ］． 香料香精化妝品，２００２（６）：２３－２６．

［１１］ 吳春，陸海燕，王昊杰． 低聚原花青素對(duì)草莓色素的抗氧化活性研究［Ｊ］．哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００３，１９（６）：６８１－６８４．

［１２］ 張迪，趙文軍，馬麗娟，等． 原花青素的性質(zhì)、功能、純化和利用［Ｊ］． 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，２００９，１５（１）：３５－４９．

［１３］ 汪多仁．原花青素的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用進(jìn)展［Ｊ］．飲料工業(yè)，２０１１，１４（４）：１１－１５．

［１４］ 肖付才． 葡萄籽原花青素檢測(cè)方法的研究［Ｄ］． 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，２００７．