付 薇，周玉鋒，干友民，王小利，張建波，

(1.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安 625014)

馬蹄金(Dichondrarepens)植株低矮，葉形美觀，成坪后無(wú)需修剪，管理成本低廉，用途多樣，在國(guó)外通常用作優(yōu)良地被綠化材料或固土護(hù)坡植物，有很高的推廣利用價(jià)值[1]。國(guó)內(nèi)許多學(xué)者對(duì)馬蹄金的生物學(xué)特征、栽培管理、生理生化等方面開(kāi)展了相關(guān)的研究工作[2-5]，但在資源收集、鑒定與評(píng)價(jià)等方面鮮見(jiàn)報(bào)道，分子水平的研究更為少見(jiàn)。我國(guó)野生馬蹄金群落分布范圍較廣，受地形、地勢(shì)及氣候差異等多方面因素影響，各地的野生馬蹄金在形態(tài)及遺傳上都存在不同程度變異，是一種極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的地被植物種質(zhì)資源四川農(nóng)業(yè)大學(xué)干友民等廣泛收集四川、云南、貴州、重慶境內(nèi)的野生馬蹄金種質(zhì)資源，在國(guó)內(nèi)首次對(duì)其遺傳多樣性、形態(tài)、生長(zhǎng)習(xí)性、生產(chǎn)繁殖性能及繁殖技術(shù)、抗脅迫能力、景觀性能等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)與篩選，發(fā)現(xiàn)野生馬蹄金具有優(yōu)良的綠化價(jià)值和生態(tài)特性，且各地區(qū)的材料在外部形態(tài)上和抗性方面存在較大的差異[6-9]。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，目前已有多種分子標(biāo)記技術(shù)(RAPD、ISSR、SSR和SRAP)被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析[10-12]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[13-14]、基因定位[15]和比較基因組學(xué)研究[16]等方面。利用單一分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)馬蹄金種質(zhì)遺傳多樣性進(jìn)行研究會(huì)因?yàn)檫@種分子標(biāo)記技術(shù)本身的局限而使結(jié)果不夠完整可靠。為此，本研究結(jié)合不同分子標(biāo)記技術(shù)的自身特點(diǎn)，以1份美國(guó)進(jìn)口品種為對(duì)照，采用RAPD和SRAP 兩種分子標(biāo)記分別對(duì)來(lái)自四川、重慶、貴州、云南的20份野生馬蹄金和1份美國(guó)進(jìn)口品種進(jìn)行分子水平遺傳多樣性研究，以期探明馬蹄金的遺傳基礎(chǔ)及不同材料間的遺傳差異，獲得較為完整的遺傳分類及親緣關(guān)系資料，為馬蹄金種質(zhì)資源保護(hù)和品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料 20份供試材料來(lái)自云南、四川、重慶、貴州等西南地區(qū)4省(市)，同時(shí)以1份美國(guó)普通馬蹄金(Common)為對(duì)照品種。全部資源保育于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系資源圃內(nèi)和貴州省草業(yè)研究所獨(dú)山基地。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1馬蹄金DNA提取 采集新鮮幼嫩的馬蹄金葉片，采用廣州達(dá)暉生物技術(shù)公司生產(chǎn)的植物基因組提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取。以已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)DNA與馬蹄金樣本DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測(cè)DNA質(zhì)量、濃度，并稀釋至10 ng·μL-1，保存于-20 ℃冰箱備用。

表1 試驗(yàn)馬蹄金材料及采集地

1.2.2RAPD反應(yīng)程序 參照張西西等[17]、田志宏等[18]的研究方法，從100個(gè)隨機(jī)引物(由北京賽百盛公司合成)中篩選出20個(gè)條帶清晰，多態(tài)性好的引物對(duì)馬蹄金DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：10×PCR buffer 2.5 μL，模板DNA 30 ng，Mg2+3.5 mmol·L-1，dNTP 300 μmol·L-1，引物0.4 μmol·L-1，TaqDNA聚合酶1.0 U，總體積為20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；前38個(gè)循環(huán)程序?yàn)?4 ℃ 30 s，38 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)0.1% 溴化乙錠染色后，凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.3SRAP反應(yīng)程序 參照Li和Quiros發(fā)表的引物[19]和袁學(xué)軍等的方法[20]，從80對(duì)引物(由上海捷瑞生工合成)中篩選出22對(duì)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，優(yōu)化后擴(kuò)增體系如下：Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTP 0.3 mmol·L-1、引物0.4 μmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0 U，模板DNA濃度10 ng·μL-1，總體積為20 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，37個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，上樣于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，IXTBE緩沖液，電泳結(jié)束后快速銀染檢測(cè)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 電泳結(jié)果數(shù)字化及多態(tài)性判斷，有多態(tài)帶記為1，無(wú)帶記為0，將所有材料的擴(kuò)增條帶轉(zhuǎn)換為0，1矩陣后，采用NTSYS-pc軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)(GS)，GS=2Nij(Ni+Nj),式中，Ni為材料i的條帶數(shù)，Nj為材料j的條帶數(shù)，Nij為i和j中都出現(xiàn)的條帶數(shù)。原始數(shù)據(jù)的整理采用Excel軟件完成，利用NTSYS-pc 2.10軟件進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算、UPGMA方法聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1馬蹄金的RAPD和SRAP標(biāo)記多態(tài)性分析 20份RAPD引物共擴(kuò)增出189條帶，其中130條具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶比率(PPB)為68.78%，擴(kuò)增條帶變幅6～13條，每個(gè)隨機(jī)引物平均產(chǎn)生6.5條多態(tài)性條帶(表2、圖1)。多態(tài)性最高的引物是SB5，達(dá)到100%；多態(tài)性最低的引物是SB6，僅為30.00%。相比之與RAPD，22對(duì)SRAP引物共計(jì)擴(kuò)增條帶242條，其中多態(tài)性條帶為175條，占總條帶的72.31%，引物組合Me5+Em4擴(kuò)增條帶最多達(dá)14條，組合Me6+Em6和組合Me8+Em2擴(kuò)增條帶最少，僅為7條，每對(duì)引物平均擴(kuò)增出7.95條多態(tài)性條帶(表3)。引物組合Me5+Em9多態(tài)性高達(dá)到90.00%，組合Me8+Em9多態(tài)性最低，僅為58.33%。相比較而言，SRAP分子標(biāo)記所檢測(cè)到的馬蹄金多態(tài)性略高于RAPD。

2.2馬蹄金親緣關(guān)系分析 利用NTSYS-pc軟件，對(duì)20個(gè)RAPD引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行遺傳相似系數(shù)(Genetic Similarity,GS)計(jì)算。GS值變化范圍為0.323～0.984，平均值為0.665，遺傳距離在0.016～0.677，平均遺傳距離為0.335。GS最大值同時(shí)出現(xiàn)在兩組四川材料中，即材料SD200309與材料SD200310以及材料SD200308與材料SD200411之間，同為0.984；材料SD200303與材料SD200512遺傳相似系數(shù)最小，僅為0.323，表明二者之間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。SRAP標(biāo)記下，GS值的變化范圍在0.479～0.942之間，平均值為0.716，遺傳距離在0.058～0.521，平均遺傳距離為0.284。與RAPD結(jié)果不同，GS最大值出現(xiàn)在兩份云南材料YD200505和YD200506之間，為0.942；GS最小值則同時(shí)出現(xiàn)在兩份云南材料YD200504與YD200506，以及美國(guó)進(jìn)口品種Common與云南材料YD200506之間，僅為為0.479。兩種分子標(biāo)記方法所檢測(cè)到的馬蹄金親緣關(guān)系存在一定的差異。

2.3馬蹄金RAPD聚類分析 根據(jù)遺傳相似系數(shù)，21份供試馬蹄金被劃分為2個(gè)類群(圖3)。結(jié)合王昆蕾等[21-22]對(duì)馬蹄金形態(tài)特征的研究來(lái)看，聚類結(jié)果與其形態(tài)特征相關(guān)。第Ⅰ類群包括9份材料，這一類群種質(zhì)葉片偏大，葉色深綠，除SD200303外，其他8份材料分枝能力較弱；SD200304、SD200303和CK在葉色、 葉片大小上都較為相似。第Ⅱ類群包括12份材料，這一類群種質(zhì)葉片較第Ⅰ類小，葉色綠。

表2 20個(gè)RAPD引物對(duì)21份馬蹄金材料擴(kuò)增結(jié)果

圖1 引物SC6對(duì)21份馬蹄金擴(kuò)增的RAPD圖譜

表3 22對(duì)SRAP引物對(duì)21份馬蹄金材料的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 Me2+Em10引物組合的SRAP 擴(kuò)增譜帶

2.4馬蹄金SRAP聚類分析 21份供試材料同樣被劃分為2個(gè)大類(圖4)，該聚類結(jié)果與筆者選用19份SRAP引物所得的聚類結(jié)果比較相似[23-24]。第Ⅰ類群由2份云南材料YD200503、YD200504、5份四川材料SD200304、SD200303、SD200405、SD200801、SD200407、1份貴州材料GD200502以及美國(guó)品種Common組成。盡管美國(guó)品種與材料GD200502聚類結(jié)果較近，且同時(shí)劃分在第Ⅰ類群，但根據(jù)筆者區(qū)域試驗(yàn)顯示[23]，Common這份材料綠色期、葉柄長(zhǎng)度、抗性等多個(gè)坪用特性較之于其他材料有很大差異。第Ⅰ類群由2份云南材料YD200506、YD200505、8份四川材料SD200302、SD200309、SD200512、SD200406、SD200513、SD200310、SD200308、SD200411 和2份貴州材料GD200504、GD200503組成，該類群材料葉片較小，葉柄較短，葉色綠，綠期較長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，22份馬蹄金材料中，除了貴州材料GD200502和美國(guó)進(jìn)口品種Common的聚類沒(méi)有明顯的聯(lián)系外，來(lái)自相似生態(tài)環(huán)境的材料能大致聚在一起，且聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)特征、坪用特性也表現(xiàn)出一定相關(guān)性。

2.5RAPD和SRAP相關(guān)性分析 本研究用篩選出的20個(gè)RAPD引物和22對(duì)SRAP引物組合對(duì)21份馬蹄金材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，RAPD擴(kuò)增結(jié)果的GS值在0.323～0.984,平均GS值為0.665。SRAP擴(kuò)增結(jié)果的GS值在0.479～0.942，平均值為0.716，差別不大。根據(jù)所得條帶進(jìn)行聚類分析，將21份馬蹄金材料按親緣關(guān)系遠(yuǎn)近劃分為不同的類群，RAPD標(biāo)記和SRAP標(biāo)記都將21分材料劃分為2個(gè)類群，并可將SRAP聚類結(jié)果看作為RAPD聚類的細(xì)化。為了檢測(cè)供試材料間的RAPD和SRAP分析結(jié)果的相關(guān)程度，利用NTSYS-pc 2.10軟件的mantel對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r0.01=0.910，二者存在極顯著正相關(guān)，說(shuō)明優(yōu)化后的RAPD和SRAP技術(shù)較為穩(wěn)定，表明應(yīng)用這2種技術(shù)對(duì)馬蹄金遺傳多樣性與親緣關(guān)系的分析具有較高的一致性和可信度。

圖3 基于Nei-Li 相似系數(shù)的21份馬蹄金材料RAPD-UPGMA聚類圖

圖4 基于Nei-Li 相似系數(shù)的21份馬蹄金材料SRAP-UPGMA聚類圖

3 討論

3.1馬蹄金種質(zhì)資源的遺傳多樣性 王昆蕾等[21-22]對(duì)23份野生馬蹄金材料進(jìn)行了形態(tài)學(xué)性狀和ISSR遺傳多樣性研究，結(jié)果表明，我國(guó)野生馬蹄金在形態(tài)上存在著豐富的遺傳變異，其中葉長(zhǎng)、葉寬、草層高度、葉柄長(zhǎng)、分枝數(shù)、主莖長(zhǎng)以及葉片、匍匐莖顏色的變異都超過(guò)20%；形態(tài)學(xué)聚類分析將23份野生材料分為4個(gè)類群：大葉高叢型、大葉矮叢型、小葉矮叢型、小葉短莖型，ISSR中23份野生馬蹄金材料GS值為0.211～0.871，平均GS值0.394，該分子標(biāo)記方法檢測(cè)的材料間遺傳距離較近。本研究通過(guò)RAPD和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)西南地區(qū)野生馬蹄金植物的遺傳多樣性進(jìn)行研究，從結(jié)果看，RAPD擴(kuò)增結(jié)果的GS值在0.323～0.984,平均GS值為0.665，SRAP擴(kuò)增結(jié)果的GS值在0.479～0.942，平均值為0.711，2種分子標(biāo)記結(jié)果的遺傳多態(tài)性分別為68.78%與72.31%，說(shuō)明本研究所用的種質(zhì)具有一定代表性，且這些結(jié)果從分子標(biāo)記的角度進(jìn)一步說(shuō)明了我國(guó)西南地區(qū)野生馬蹄金種質(zhì)資源間存在豐富的遺傳變異。

3.2聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)相關(guān)性 聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)具有一定的相關(guān)性。在RAPD聚類中，云南材料YD200503、YD200504、四川材料SD200304、SD200303、SD200405、SD200801、SD200407、貴州材料GD200502以及對(duì)照品種Common聚為第Ⅰ類，這9份材料的葉片偏大，草層高度整體較第Ⅱ類材料高，主莖長(zhǎng)度總體比第Ⅱ類材料稍短；第Ⅱ類的12份種質(zhì)除SD200308葉片相對(duì)較大以外，其他11份材料葉片較第Ⅰ類小，主莖節(jié)總體長(zhǎng)于第Ⅰ類群，草層矮，分枝能力強(qiáng)。SRAP聚類與RAPD基本相同，材料的栽培品種，由于長(zhǎng)期適應(yīng)不同生長(zhǎng)盡管貴州材料GD200502和美國(guó)對(duì)照品種的遺傳相似系數(shù)達(dá)0.905，親緣關(guān)系近，但兩者在形態(tài)特征和坪用特征上差異較大，解釋這一現(xiàn)象的最大可能性為GD200502是另一個(gè)有別于對(duì)照環(huán)境導(dǎo)致外觀形態(tài)出現(xiàn)變異，對(duì)二者是否屬于同一種可在今后的試驗(yàn)中進(jìn)一步深入研究。此外，近幾年來(lái)，為更好研究物種遺傳多樣性，研究者們傾向于采用多種分子標(biāo)記探索物種基因信息。有研究[23]表明,不同的分子標(biāo)記研究的結(jié)果可能是一致的，也可能并不一致,在許多情況下，形態(tài)同基因型間并無(wú)直接聯(lián)系，形態(tài)性狀的趨異不一定能反映遺傳上的趨異，形態(tài)性狀的相似也不一定意味著遺傳關(guān)系的近緣，兩個(gè)形態(tài)上有差異的個(gè)體可能在遺傳上非常的相似[25]。

3.3聚類結(jié)果與地理分布相關(guān)性 聚類結(jié)果除了與形態(tài)特征具有一定相關(guān)性外，與馬蹄金起源及分布范圍有關(guān)，這一結(jié)論與王昆蕾[22]ISSR分析結(jié)論相似，即：相似形態(tài)特征的材料能聚成一類，相近生境條件的材料也能聚成一類。如來(lái)自云南的材料YD200503、YD200504、YD200506、YD200505，雖然沒(méi)有聚在同一大類，但它們也在各大類中單獨(dú)聚在一起。四川材料SD200304、SD200303、SD200405、SD200801、SD200407，這5份材料遺傳距離較近，RAPD和SRAP聚類中，5份材料都能首先聚在一起，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能與它們的起源和分布區(qū)域相似性有關(guān)。來(lái)自云南的2份材料YD200503和YD200504生態(tài)環(huán)境相似，也能相互聚在一起。另外，來(lái)自云南的2份材料YD200506、YD200505親緣關(guān)系很近，在SRAP遺傳相似系數(shù)分析中，二者GS值最高，達(dá)0.942，RAPD遺傳相似系數(shù)分析中GS值也高達(dá)0.934，二份材料的生態(tài)環(huán)境較接近，初步猜測(cè)很有可能是同一種，但兩者是否屬同一材料還有待于進(jìn)一步研究。

3.4西南區(qū)野生馬蹄金種質(zhì)資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用 本研究結(jié)合前期形態(tài)遺傳多樣性研究，以1份美國(guó)品種為對(duì)照，對(duì)西南地區(qū)20份野生馬蹄金材料進(jìn)行了RAPD和SRAP分子遺傳標(biāo)記，通過(guò)兩種分子標(biāo)記方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)，初步對(duì)不同野生馬蹄金植物形態(tài)特征及生物學(xué)特征存在的差異進(jìn)行研究，了解馬蹄金種資源遺傳變異及其地理分布規(guī)律，對(duì)今后種質(zhì)的保護(hù)研究以及野生資源的有效合理利用有重要意義。研究結(jié)果表明，我國(guó)野生馬蹄金材料間存在豐富的遺傳變異，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其原生境保護(hù)或異地保護(hù)，防止人類活動(dòng)造成的基因混雜。我國(guó)有大量野生馬蹄金分布，今后可擴(kuò)大采集范圍，進(jìn)一步開(kāi)展野生材料的收集工作，為國(guó)內(nèi)優(yōu)良本土草坪草及地被植物馴化和育種提供豐富的種質(zhì)資源。

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