袁正洲 綜述,李作孝 審校
(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川瀘州 646000)
重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是一種主要由乙酰膽堿受體抗體(acetylcholine receptor antibody,AchRab)介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞依賴的自身免疫性疾病。病變部位位于神經(jīng)-肌肉的突觸后膜,該膜上煙堿乙酰膽堿受體(nAchR)受到攻擊后數(shù)量減少,導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭遞質(zhì)傳遞障礙[1]。細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱之為細(xì)胞程序化死亡(programmed cell death),是指在特定內(nèi)源和外源信號誘導(dǎo)下,細(xì)胞內(nèi)死亡程序激活而致的細(xì)胞主動自殺,也是增殖的淋巴細(xì)胞被清除的主要方式[2]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展受到多種凋亡相關(guān)基因調(diào)控。引起MG免疫應(yīng)答的具體始動環(huán)節(jié)目前還不是很清楚,但有研究表明淋巴細(xì)胞凋亡基因調(diào)節(jié)失控與MG的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系緊密[3]。Bcl-2是調(diào)控淋巴細(xì)胞凋亡的重要家族,該家族成員眾多,不同成員對凋亡作用亦有差異。本文對Bcl-2基因家族與MG淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)系進(jìn)行綜述。
1.1Bcl-2基因家族的組成 Bcl-2基因定位于18號染色體(18q21),包括2個內(nèi)含子及3個外顯子,其第1個外顯子無翻譯功能,第2個內(nèi)含子具有非翻譯區(qū)。第2、3個外顯子具備編碼的功能,Bcl-2基因產(chǎn)物通過這兩個外顯子編碼[4]。Bcl-2基因家族可分為3個亞家族:(1)Bcl-2亞家族:抗細(xì)胞凋亡,成員有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、Al和Diva等;(2)Bax亞家族:促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,如Bak、Bcl-xS、Bax及Bok等;(3)BH3-only(Bcl-2 homology 3 only)蛋白亞家族:具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能,成員包括Bik、Bad、Bid、Bim、Hrk、Puma、Noxa等[5-6]。
1.2Bcl-2基因家族的結(jié)構(gòu)及功能 Bcl-2家族蛋白的主要結(jié)構(gòu)由2大結(jié)構(gòu)域構(gòu)建:(1)位于羧基端的跨膜結(jié)構(gòu)域;(2)數(shù)量不等(1~4個)的BH。BH-3結(jié)構(gòu)域與促進(jìn)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān),在促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程中扮演著至關(guān)重要的角色,被視為死亡結(jié)構(gòu)域[7]。BH-4結(jié)構(gòu)域作為抗凋亡蛋白所特有的一種結(jié)構(gòu)域,在其缺失的情況下,可使抗凋亡蛋白出現(xiàn)功能活性的喪失。螺旋結(jié)構(gòu)BH1-4結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在大多數(shù)的抗凋亡蛋白亞家族結(jié)構(gòu)域中。BH-3結(jié)構(gòu)域則為促凋亡蛋白亞家族結(jié)構(gòu)所共享,但促凋亡蛋白亞家族缺少a螺旋片段BH-4結(jié)構(gòu)域,而BH3-only蛋白亞家族結(jié)構(gòu)中僅含有BH-3結(jié)構(gòu)域。大部分成員都有跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain,TM),這有助于它們固定在如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體等胞內(nèi)細(xì)胞器膜上。
Bcl-2家族蛋白的相對濃度調(diào)控細(xì)胞凋亡線粒體通路,在其調(diào)控下,蛋白質(zhì)由線粒體膜間隙轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中[8]。Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bak及Bax作用于線粒體,通過在其外膜孔釋放細(xì)胞色素c激活細(xì)胞的凋亡程序。Bak和Bax的聚合物(二聚體或多聚體)形成細(xì)胞色素c通過的孔洞,而抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-xL通過競爭性地與Bak和Bax結(jié)合而阻止細(xì)胞色素c漏出,影響胱冬酶3(caspase-3)的激活,從而抑制細(xì)胞凋亡[9]。
Bcl-2的表達(dá)在淋巴細(xì)胞成熟及建立正常免疫系統(tǒng)過程中呈階段性的變化。在胸腺組織的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行陽性選擇過程中Bcl-2表達(dá)出現(xiàn)下降趨勢,從而誘導(dǎo)CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑,而CD4+及CD8+單陽性T淋巴細(xì)胞中的Bcl-2水平卻表現(xiàn)為上升趨勢,這使T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育成熟,進(jìn)而建立起穩(wěn)定的正常免疫系統(tǒng)[10]。Bcl-2可結(jié)合與細(xì)胞凋亡有關(guān)的R-rasp23、Raf-1等信號傳導(dǎo)分子,通過影響分子信號的傳導(dǎo)通路而抑制細(xì)胞凋亡[11]。
2.1胸腺組織中Bcl-2基因家族表達(dá)與MG發(fā)病的關(guān)系 65%以上MG患者胸腺增生,病理改變?yōu)榱馨蜕l(fā)中心增生,其中心有B淋巴細(xì)胞存在。10%MG并發(fā)胸腺瘤,病理改變?yōu)榱馨图?xì)胞增生,大部分為T淋巴細(xì)胞。通過原位雜交技術(shù)對MG伴胸腺增生患者進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)正常胸腺組織中的Bcl-2主要表達(dá)在髓質(zhì)和少量皮質(zhì)中,生發(fā)中心只有很少的Bcl-2陽性細(xì)胞,上皮組織中則不表達(dá)陽性細(xì)胞。在MG合并胸腺瘤患者中,Bcl-2的蛋白和mRNA在上皮組織中出現(xiàn)表達(dá),同時髓質(zhì)中Bcl-2表達(dá)高于對照組。該實驗同時表明Bax的蛋白和mRNA在正常胸腺組織中表達(dá)主要在髓質(zhì)、少量在皮質(zhì)。而在MG胸腺中,Bax蛋白和mRNA表達(dá)主要在上皮、少量在髓質(zhì),且生發(fā)中心高表達(dá)Bax產(chǎn)物,Bax陽性細(xì)胞數(shù)量與MG的Osserman分型呈正相關(guān)。這意味著Bcl-2基因表達(dá)的上調(diào)可導(dǎo)致胸腺上皮細(xì)胞具備抗凋亡能力,最終致使MG發(fā)生進(jìn)展,而Bax在生發(fā)中心高表達(dá)則提示高凋亡指數(shù)[12]。
Kondo和Yoshino[13]用TUNEL法對MG患者的胸腺生發(fā)中心檢測原位DNA片段,發(fā)現(xiàn)MG發(fā)病可能是因為Bcl-2的上調(diào),導(dǎo)致自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞逃脫陰性選擇,產(chǎn)生了過量的AchRab從而引發(fā)自身性免疫反應(yīng)。另有研究[14]報道稱MG患者的胸腺中Bcl-2基因表達(dá)增加,抑制了正常免疫細(xì)胞的凋亡發(fā)生。其免疫細(xì)胞成熟過程中因自身反應(yīng)性胸腺細(xì)胞受損,異常克隆細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受紊亂,使淋巴細(xì)胞增殖異常而致B淋巴細(xì)胞持續(xù)分泌AchRab。由此可見,Bcl-2基因表達(dá)增加可抑制MG患者淋巴細(xì)胞的正常凋亡過程,這可能是導(dǎo)致MG患者自身免疫疾病發(fā)生的機(jī)制之一。
Bax與Bcl-2的比例決定了細(xì)胞凋亡的易感性。通過對經(jīng)過胸腺切除術(shù)治療的MG患者進(jìn)行研究,Salakou等[15]發(fā)現(xiàn)MG患者胸腺中的Bcl-2水平明顯高于陰性對照組,陽性胸腺組織重量顯著比陰性胸腺增加。Bcl-2基因下調(diào)可破壞胸腺細(xì)胞的分化更新,長期存活的細(xì)胞大量累積,從而導(dǎo)致MG胸腺腫瘤的發(fā)生。Bax的mRNA及蛋白質(zhì)促進(jìn)MG淋巴細(xì)胞凋亡,Bax與Bcl-2的比例可上調(diào)caspase-3從而激活和調(diào)節(jié)與MG進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞凋亡。同時發(fā)現(xiàn)在Bax/Bcl-2比值小于1的情況下,即使沒有進(jìn)行藥物治療,也可出現(xiàn)病情改善甚至完全緩解的情況,這個比值可能是一個獨(dú)立的預(yù)后因素。
2.2外周血Bcl-2基因家族表達(dá)與MG發(fā)病的關(guān)系 在MG患者的外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中,Bcl-2的mRNA表達(dá)較對照組明顯高于對照組,且CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群及CD19+細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)也明顯升高,同時CD3+T細(xì)胞蛋白表達(dá)Bcl-2的平均熒光強(qiáng)度亦升高[16]。PBMC中Bcl-2的mRNA相對表達(dá)量與MG患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān),極重型、重型及中型患者PBMC中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平要明顯高于輕型患者[17]。
MG患者PBMC中Bcl-2高表達(dá),而Bad、Bax表達(dá)水平低[18]。CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡程度顯著低于空白對照組,而CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡程度介于二者之間,說明MG患者PBMC中T淋巴細(xì)胞凋亡存在障礙,且凋亡障礙以CD4+T淋巴細(xì)胞為主。這導(dǎo)致清除活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞不及時,T輔助細(xì)胞的功能相對亢進(jìn),B細(xì)胞在活化的T細(xì)胞作用下增殖活躍,進(jìn)而導(dǎo)致免疫應(yīng)答過強(qiáng),產(chǎn)生眾多針對自身免疫系統(tǒng)的抗體,從而致使MG的發(fā)生[19]。
MG患者的PBMC的CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡程度因不同臨床類型及預(yù)后而高低明顯不同。與空白對照組相比,MG患者組中PBMC的CD8+T淋巴細(xì)胞所占比例顯著下降,CD4+T與CD8+T的比值明顯增高,而CD4+T細(xì)胞所占比例無顯著差異。這表明MG患者的T淋巴細(xì)胞亞群分布存在異常,抑制性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著降低,導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的抑制能力下降,B淋巴細(xì)胞在T細(xì)胞亞群異常分布的調(diào)節(jié)下失控[20]。Bcl-2基因在胸腺T淋巴細(xì)胞進(jìn)行陽性選擇時表達(dá)下降,調(diào)節(jié)CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞進(jìn)入正常的凋亡程序,而CD4+及CD8+單陽性T淋巴細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)則上調(diào)使之進(jìn)一步發(fā)育,由此構(gòu)建正常的免疫體系。MG患者中胸腺T淋巴細(xì)胞進(jìn)行陽性選擇時,Bcl-2基因表達(dá)顯著下降,從而促使CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞進(jìn)入異常的細(xì)胞凋亡程序[21]。
Bcl-2表達(dá)異常致使免疫細(xì)胞的凋亡失控,因而引起MG患者細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能紊亂。應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療后,MG患者血清里面Bcl-2的mRNA水平表現(xiàn)為明顯的降低且其水平與病情嚴(yán)重程度相關(guān),這表明Bcl-2的mRNA水平可作為反映MG治療的效果的一個指標(biāo)[22]。Delfino等[23]的研究表明,表達(dá)Bcl-2的PBMC在培養(yǎng)過程中不但能夠長期生存,還可以持續(xù)產(chǎn)生反應(yīng)程度劇烈的抗原,而這種抗原反應(yīng)產(chǎn)生的變化是活化的T淋巴細(xì)胞凋亡被強(qiáng)力抑制的結(jié)果,且與Bcl-2基因家族中抗凋亡亞族的表達(dá)呈正相關(guān)。
Bcl-2基因家族作為調(diào)控淋巴細(xì)胞凋亡的重要因子,在MG的早期診斷、判斷預(yù)后及治療中發(fā)揮重要作用。目前,國內(nèi)外治療MG大多是通過胸腺切除術(shù)、膽堿酯酶抑制劑、腎上腺皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等方法[24],但其長期全身廣泛性的免疫抑制會產(chǎn)生諸多的不良反應(yīng)。應(yīng)用基因工程表達(dá)凋亡基因細(xì)胞的外蛋白,能有效消除自身免疫[25]。隨著Bcl-2基因家族作用機(jī)制逐步明確,通過糾正其對淋巴細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)失控,從而改善乃至完全緩解MG的病情,可成為治療MG新的研究方向。以Bcl-2基因家族作為靶點(diǎn)研發(fā)新的治療藥物和設(shè)計新的治療方案,對MG的臨床治療具有潛在重大價值。
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