耿萬友，付作寬，周 霞，王學(xué)理，杜立銀

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028042；2.科爾沁區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，內(nèi)蒙古通遼028042）

副豬嗜血桿菌?。℉aemophilosis parasuis，HPS）是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的一種泛嗜性細菌性傳染病，早在1906年由德國學(xué)者Gllisser發(fā)現(xiàn)，故又稱“革拉瑟氏病”（Gllisser＇s disease）［1］。本病以纖維性多漿膜炎、腦膜炎和多關(guān)節(jié)炎為主要特征，并伴有發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、共濟失調(diào)和被毛粗亂等癥狀。Hps主要侵害仔豬尤其是早期斷奶仔豬，4周齡～8周齡的豬對Hps也較敏感，本病的發(fā)病率一般在10%～20%，病死率有時可高達50%。

本病呈世界性分布，據(jù)不完全統(tǒng)計，有38.9%～77.8%的豬攜帶潛在的致病菌［2］。我國也從規(guī)模化養(yǎng)豬場中分離到了該病原菌。Hps感染已經(jīng)成為早期斷奶仔豬和高度健康豬群的威脅，嚴重的影響了地區(qū)及世界經(jīng)濟的發(fā)展，現(xiàn)將近幾年關(guān)于副豬嗜血桿菌病的研究進展闡述如下。

1 病原學(xué)

副豬嗜血桿菌（Hps）是革蘭陰性、非溶血NAD依賴性短小桿菌，屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬中的成員。在顯微鏡下Hps呈球形、棒狀或絲狀，無鞭毛、芽胞，通?？梢娗v膜，美藍染色呈兩極著色。Hps對pH變化和熱應(yīng)激都非常敏感。Hps生長緩慢，而且對于營養(yǎng)物質(zhì)的需求也特別挑剔，有時需要加入特定的X、V等生長因子，這些條件就使得對Hps感染樣本的采集、恢復(fù)以及運輸造成很大的困難。一般使用巧克力瓊脂板，在溫度為37℃、體積分數(shù)為5%的CO2條件下進行培養(yǎng)，最適pH為7.6～7.8。Hps對外界環(huán)境的抵抗力不強，干燥環(huán)境可使其死亡，一般在60℃經(jīng)5min～20min內(nèi)死亡，常用的消毒藥物也可將其殺死，4℃下可存活7d～10d［3］。

根據(jù)表性特征和致病能力，應(yīng)用傳統(tǒng)的血清學(xué)方法可將副豬嗜血桿菌分為15個標(biāo)準(zhǔn)血清型，但是由于有限的分辨率和不同實驗室間結(jié)果比較的困難，仍然有一部分臨床分離菌株不能用血清學(xué)方法分類定型，這就表明還存在其他血清型的可能［4］。同時由于未定型的菌株和標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株毒力多變性的存在，使血清型分類方法也存在一定的局限性。但是值得注意的是必須有效控制地區(qū)流行的血清型，因為不同血清型甚至是同一血清型不同菌株之間的致病力、疫苗的交叉保護以及預(yù)防治療都存在很大的差異，比如血清型2菌株Bakos A9，血清型14菌株H792和血清型4菌株9904108是沒有致病力的，但血清型2菌株SW124和血清型4菌株SW140與腹腔接種相比，鼻內(nèi)接種以后，可以起到保護治療的作用。相反，無毒性的血清型7和11能從感染Hps的豬的鼻液中分離得到，而且用血清型7菌株373／03A鼻內(nèi)接種，可使1／6的豬復(fù)發(fā)［2］。

有許多分子生物學(xué)方法應(yīng)用到Hps的血清型分類中，如限制性核酸內(nèi)切酶圖譜法、雙酶切電泳法 、重復(fù)基因共有序列PCR、外膜蛋白圖譜等，Del Rio M L等［5］在對比應(yīng)用協(xié)同凝集試驗（CA）和間接血凝試驗（HIA）檢測各種臨床分離株血清型的試驗中發(fā)現(xiàn)HIA在敏感性和特異性上都是一種很可靠的Hps分型方法。但也有人認為有些分離株因為特別難生長或者生長緩慢而不能從鼻拭子中得到，比如血清型12，也有一些是因為異源性的存在給臨床分類帶來了困難［6］。Hps從強毒株到無毒株都有分布，現(xiàn)在15種血清型中最流行是4型和5型，其次是13、14和12型。1、5、10型毒力最強，8型和15型為中等毒力，認為3型和6型與臨床癥狀無關(guān)。但是到目前為止，毒力的分子基礎(chǔ)還未確立，血清學(xué)、吞噬抑制和內(nèi)皮細胞的入侵可能都與Hps的毒力有關(guān)［7］。

2 流行病學(xué)

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道共生菌，也是早期寄生在小豬鼻液中的細菌之一，可以通過拭子從感染Hps豬的鼻腔、扁桃體和氣管中分離得到。但是為了能夠分離到致病性的Hps以及對分離到的Hps進行分類定型，一般建議不使用拭子，因為這樣常常會分離到非致病性的Hps，一般都從病死豬尸體的心臟、肺臟和腦等組織或腹腔液、腦室液、心包液及關(guān)節(jié)液中分離致病菌［8］。病豬和攜帶致病菌的豬是主要的傳染源。本病主要通過空氣經(jīng)呼吸道傳播，病原也可以經(jīng)過排泄物、分泌物等污染飼料和飲水。有人發(fā)現(xiàn)經(jīng)產(chǎn)母豬的胎衣等分泌物中Hps的含量要比初產(chǎn)母豬高出許多［9］。另外，生長環(huán)境的惡劣、營養(yǎng)不良、天氣的突變、不同日齡豬的混養(yǎng)、提前斷奶、轉(zhuǎn)群以及運輸?shù)雀鞣N應(yīng)激因素都有可能是誘發(fā)本病的原因［10］。

副豬嗜血桿菌只感染豬，具有很強的宿主特異性，未經(jīng)免疫的或是4周齡～8周齡的保育豬都容易感染。曾經(jīng)有人認為本病是仔豬的散發(fā)性、應(yīng)激性疾病，然而無特定病原體種群的建立，增加了本病在全世界范圍內(nèi)的流行［11］。本病的發(fā)生主要與各種應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致豬的抵抗力下降有關(guān)系，在一定范圍內(nèi)，健康豬也攜帶Hps，即使是無HPS暴發(fā)的豬場。如果豬群存在其他的傳染病，導(dǎo)致抵抗力下降時，使豬群更加易感Hps，致使病情更加復(fù)雜化，而且由于HPS復(fù)雜的流行病學(xué)，不同豬場間帶菌豬分布的多變性，給臨床診斷和治療都帶來了很大的困難。

3 臨床癥狀

根據(jù)臨床癥狀和病程，感染Hps的臨床癥狀可以是急性的，也可以是慢性的，這主要取決于炎性損傷的部位和種群整體的免疫狀態(tài)，一般高度健康的豬群，發(fā)病很急，接觸病原后幾天內(nèi)就會發(fā)病，隨后可能出現(xiàn)死亡［12］。

3.1 急性型

一般膘情良好的豬會突然發(fā)病，體溫升高至40.5℃～42℃，精神沉郁，食欲下降，咳嗽，呼吸困難并表現(xiàn)為腹式呼吸。體表皮膚發(fā)紅，耳稍發(fā)紫，指壓不褪色。有時腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)會發(fā)生炎癥，驅(qū)趕時病豬發(fā)生尖叫，共濟失調(diào)［13］。臨死前常常側(cè)臥或四肢呈劃水樣，一般無明顯癥狀而突然死亡，有時發(fā)病1d～5d死亡。

3.2 慢性型

多發(fā)生于保育階段的豬，常由急性型轉(zhuǎn)化而來，一般呈慢性經(jīng)過，病豬多見關(guān)節(jié)和后腿明顯腫脹，生長不良，衰弱，被毛粗亂，出現(xiàn)間歇熱，結(jié)膜發(fā)紺，隨后全身發(fā)紫，站立不穩(wěn)，有時頭頂墻角而不能收回，進行性消瘦，有時甚至是因衰竭而死亡，同時也易受沙門菌、多殺性巴氏桿菌等其他病原微生物的侵害而發(fā)生繼發(fā)或并發(fā)癥［14］。

4 病理變化

4.1 病理剖檢變化

病豬皮膚發(fā)紺，耳背面尤為明顯。主要特征為多纖維性漿膜炎和多關(guān)節(jié)炎，全身淋巴結(jié)腫大、出血，切面多汁外翻。胸腔積液呈淡紅色并伴有大量纖維素滲出及凝血塊。肺臟呈纖維素性胸膜肺炎，膨脹呈暗紫紅色，充血、出血，有時表面還覆有纖維素性滲出物，常常與胸壁粘連。在病程較長的病例中，常常因為炎性滲出物，使心外膜和心臟粘連在一起，形成明顯的“絨毛心”，成為本病最具特征的病理變化［15］。病死豬脾臟腫大，體積為正常的2倍～3倍，周邊出現(xiàn)壞死灶，切開腫大的關(guān)節(jié)，有大量纖維素性滲出物。此外，有時腎臟和腸道也有明顯的病理變化。

4.2 病理組織學(xué)變化

4.2.1 心臟 表面有大量的纖維素滲出，其中含有大量的單核細胞、淋巴細胞、漿細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等炎性細胞浸潤。表層心肌纖維腫脹，排列紊亂，斷裂，細胞腫脹及壞死。間質(zhì)毛細血管充血，有炎性細胞浸潤。

4.2.2 肺臟 呈纖維素性胸膜肺炎，有漿液滲出，支氣管、肺泡內(nèi)有大量的炎性細胞浸潤，其中以中性粒細胞為主。原有的肺臟被膜消失。肺小葉嚴重充血、出血，有大量紅細胞滲出，并伴有炎性細胞浸潤［16］。

4.2.3 脾臟 脾炎，表面有網(wǎng)狀纖維素滲出，其間有大量的炎性細胞和少量紅細胞。結(jié)締組織增生、水腫，血管擴張充血，平滑肌纖維腫脹、崩解，脾臟實質(zhì)內(nèi)白髓體積縮小，邊緣區(qū)和紅髓出血。有時脾小體的生發(fā)中心也變小甚至觀察不到生發(fā)中心［17］。

4.2.4 肝臟 表面有纖維素滲出，其間有大量中性粒細胞、淋巴細胞和漿細胞，常常由于中性粒細胞的崩解而形成膿腫。肝細胞腫大、壞死，形成壞死灶，中央靜脈擴張充血，肝血竇內(nèi)皮細胞脫落，肝小葉間質(zhì)血管擴張充血，局部小葉間質(zhì)增生［18］。

此外，有時也伴隨有腦膜炎，腸道炎癥的發(fā)生，而且有中性粒細胞等炎癥細胞的浸潤。

5 診斷

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化可做出初步診斷，確診還需要做進一步的細菌分離鑒定。通常實驗室可以無菌采集病死豬心臟、脾臟、肺和淋巴結(jié)等處病料，無菌接種于巧克力瓊脂板上，然后垂直于劃線接種金黃色葡萄球菌，在溫度為37℃、體積分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)48h，可見明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，有助于對本病的診斷。另外，還可以對原代培養(yǎng)的病原菌進行PCR鑒定，也可以通過瓊脂擴散試驗、補體結(jié)合試驗和間接血凝試驗等血清學(xué)方法做進一步確診［19］。

Turni C等［6］通過用編碼2個轉(zhuǎn)錄抑制因子（IF2-IF2α）和（IF2β）的InfB基因為靶基因，利用實時PCR對Hps野外株的診斷獲得了較理想的效果。與存在特異性問題的常規(guī)PCR相比，實時PCR對于HPS的診斷結(jié)果非?？煽?，因此實時PCR的高特異性和敏感性成為診斷HPS非常有效的方法，這一方法的應(yīng)用也將提升實驗室診斷HPS的能力，特別是不具備Hps培養(yǎng)的實驗室。

Olvera A等［2］通過試驗證實Hps中含有一個與毒力相關(guān)的自身運載體（vtaA）基因，而且通過分析它們的轉(zhuǎn)運區(qū)域，可以將這一基因分成三部分，基因組雜交比較結(jié)果顯示vtaA-3具有高度的保守性，因此以vtaA基因為靶基因，利用多重PCR可以有效的診斷出Hps的感染以及區(qū)分出分離株中非致病性菌株的存在。也有人以16SRNA基因為靶基因來診斷Hps的感染，但是結(jié)果較其他方法存在一定的差異［17］。最后要做出正確的診斷，還需要臨床工作者豐富的診斷經(jīng)驗，結(jié)合臨床癥狀和病理變化做出科學(xué)的診斷結(jié)果。

6 防控

6.1 預(yù)防

目前對本病的預(yù)防還存在一定的局限性，只能從日常的飼養(yǎng)管理和疫苗免疫等方面著手，到現(xiàn)在為止，還沒有一種特效的多價疫苗能夠有效地預(yù)防本病的發(fā)生，而且由于致病菌的多變異性，疫苗的交叉保護也很差。

先天免疫反應(yīng)是脊椎動物防御病原微生物入侵的第一道防線，這期間起主要作用的是中性粒細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等吞噬細胞，其中巨噬細胞做為先天免疫的主要成分，對宿主防御病原微生物的感染起著至關(guān)重要的作用，通過釋放細胞因子和趨化因子，維持宿主的免疫反應(yīng)［12］。因此，可以從以下幾點保護宿主的先天免疫，預(yù)防本病的發(fā)生。

6.1.1 嚴格執(zhí)行日常的飼養(yǎng)管理制度 保持圈舍內(nèi)外良好的衛(wèi)生環(huán)境，溫度、濕度適宜，通風(fēng)良好，飼養(yǎng)密度適中，不同日齡的豬不混養(yǎng)。還要對外來車輛和人員進行嚴格的消毒，以免帶入外源性致病菌株。另外還要堅持“全進全出”，發(fā)現(xiàn)疑似病例要馬上隔離或捕殺淘汰，并進行環(huán)境消毒和疫苗免疫，以防病原菌的傳播擴散。

6.1.2 藥物預(yù)防和免疫接種 定期在飼料和飲水中加入一定量的慶大霉素、氟苯尼考、阿莫西林等抗生素可以有效的預(yù)防該病的發(fā)生，疫苗的使用也是有效控制此病發(fā)生的方法之一，但是由于該病的病原菌血清型較多，致病菌株多樣性的存在，不同血清型之間疫苗的交叉保護較差等原因，最好使用副豬嗜血桿菌多價滅活苗，有條件的豬場可以采集本場的病料制做自家苗，以更好的預(yù)防本病的發(fā)生。

OMPA是革蘭陰性菌的主要外膜蛋白，具有高度保守性，它的主要功能是參與細胞膜的形成、噬菌體結(jié)合、細胞生長和侵害哺乳動物細胞等，Hps也含有這種蛋白。有研究表明，免疫接種血清中抗體能定向?qū)筄MPs，而且OMPs的免疫原性較Hps的其他成分都高，所以O(shè)MPA有可能成為治療HPS亞單位疫苗的候選者［20］。

6.2 治療

近些年來，由于斷奶的提前和三點生產(chǎn)方式的使用等生產(chǎn)方式的改變，使Hps感染成為引起高死亡率、給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失的主要原因，特別是對無特定病原菌的豬群［21］。當(dāng)豬群中出現(xiàn)臨床癥狀或嚴重的病理變化時，許多抗生素的治療效果都不是很理想，僅能控制癥狀的進一步惡化。而且不同血清型之間對同一種抗生素的敏感性也存在很大的區(qū)別，在用藥治療前最好先對分離菌株做藥敏試驗，以選擇最好的藥物進行治療。

Guo L L等［11］在研究氟喹諾酮抵制Hps的分子特征試驗中，發(fā)現(xiàn)深入理解氟喹諾酮抵制Hps的機制可以有效的控制和治療Hps感染。然而由于血清型的多樣性和一部分非致病性菌株的存在，沒有可以提供有效交叉保護免疫的疫苗，因此抗菌藥物的應(yīng)用成為日趨重要的有效抵制此病原體的方法。不幸的是，氟喹諾酮的廣泛使用許使多國家的Hps產(chǎn)生了耐藥性。到目前為止，尚未闡明氟喹諾酮抵制Hps的機制，但相信可以為以后的進一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

Tian H B等［3］在應(yīng)用ELISA方法探討MAb1D8與Hps血清型反應(yīng)敏感性的試驗中發(fā)現(xiàn)中和性MAb1D8能夠與所有的15種和野外分離株HLJ-018反應(yīng)。相比之下被動免疫結(jié)果也表明用1D8腹腔內(nèi)接種小鼠，能夠有效地抵制Hps在血液、肺、脾、肝等處的寄居，而且還能夠延長生存時間。此外，被動轉(zhuǎn)運試驗表明，MAb1D8能夠使小鼠免受同源或異源性Hps的攻擊。對于內(nèi)源性致病菌的攻擊，疫苗是一條有效地控制方式，但是在交叉保護試驗中也出現(xiàn)了變異，因此必須尋求新的治療方法。

7 結(jié)語

迄今為止，研究人員已對HPS進行了一系列的研究探索，也取得了許多顯著的成就，但是仍有許多問題尚未解決，比如許多分離株的血清型還不能分類定型，Hps感染的分子基礎(chǔ)也不十分清楚，在實踐中PCR方法和Southern blot方法的應(yīng)用也存在困難［19］。這些難題都需要科學(xué)工作者進一步的研究探討，以更加深入的了解HPS和尋找到一種更好的診斷治療方法。

以前認為本病只會在應(yīng)激條件下的豬只中發(fā)生，但是現(xiàn)在也有無應(yīng)激豬只發(fā)病的報道，這可能是因為一種非致病性血清型的流行影響了其他致病菌株的檢測，因而健康豬只不適宜用于所有血清型的檢測，另外，樣本量的大小對于一個農(nóng)場中所有血清型的檢測也是非常重要的。

近些年來以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的疫苗備受關(guān)注，通過免疫保護分析，鑒定出許多具有免疫原性的OMPs，這對于單價和多價亞單位疫苗的生產(chǎn)是至關(guān)重要的，但是有報道稱Hps OMPA誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)是有限的，還有待于進一步證實。另外，通過觀察基因圖譜可以篩選出潛在的宿主代理，可以減少Hps的流行和進一步理解Hps的致病機制。

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