鄧明俊，肖西志，孫 濤，孫 敏，鄭小龍，王 群，張曉文，孫明君，朱來(lái)華

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266002）

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)（Giardia lamblia，簡(jiǎn)稱(chēng)賈第鞭毛蟲(chóng)）是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)原蟲(chóng)，也是人體腸道感染的常見(jiàn)寄生蟲(chóng)病之一，常引起人的腹瀉、腹痛和消化不良等癥狀。賈第鞭毛蟲(chóng)分布于世界各地，近十多年來(lái)，由于旅游事業(yè)的發(fā)展，在旅游者中發(fā)病率較高，故又稱(chēng)“旅游者腹瀉”。起初，人類(lèi)對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的認(rèn)識(shí)還不夠深入，認(rèn)為該蟲(chóng)只是一種共生性的腸道原蟲(chóng)。隨著后來(lái)世界各地相繼發(fā)生了賈第鞭毛蟲(chóng)病的暴發(fā)和流行，其危害性不斷顯現(xiàn)，人類(lèi)才真正開(kāi)始了對(duì)該寄生原蟲(chóng)的深入研究。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，全世界人群賈第鞭毛蟲(chóng)感染率為1%～30%，兒童感染率最高。因此，該寄生原蟲(chóng)已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為危害人類(lèi)身體健康重要寄生蟲(chóng)之一。為使大家能對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)病以及相關(guān)檢測(cè)技術(shù)有一個(gè)全面的認(rèn)識(shí)和了解，本文對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)最新檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行如下綜述。

1 賈第鞭毛蟲(chóng)的生理特性

1.1 生活史

賈第鞭毛蟲(chóng)的生活史屬人際傳播型，整個(gè)過(guò)程中有滋養(yǎng)體和包囊兩個(gè)不同的發(fā)育階段。滋養(yǎng)體呈倒置梨形，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)，背面隆起，腹面扁平。腹面前半部向內(nèi)凹陷成吸盤(pán)狀陷窩，賈第鞭毛蟲(chóng)借此吸附在宿主腸黏膜上。滋養(yǎng)體有4對(duì)鞭毛，依靠鞭毛的擺動(dòng)，可隨意運(yùn)動(dòng)。滋養(yǎng)體期以滲透方式從體表吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。賈第鞭毛蟲(chóng)的包囊呈橢圓形，囊壁較厚。包囊經(jīng)過(guò)碘液染色呈黃綠色，囊壁與蟲(chóng)體之間有明顯的空隙，未成熟的包囊有2個(gè)核，成熟的包囊具4個(gè)核，多偏于一端。滋養(yǎng)體為營(yíng)養(yǎng)繁殖階段，而包囊為傳播階段。滋養(yǎng)體主要寄生于人和某些動(dòng)物的十二指腸或上段小腸，偶爾寄生于膽道或胰管，以二分裂方式進(jìn)行繁殖。包囊對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，為傳播階段。

1.2 流行特征

賈第鞭毛蟲(chóng)的包囊對(duì)人具有高度的感染性，任何人群對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)均易感。據(jù)報(bào)道，人吞食10個(gè)具有活力的賈第鞭毛蟲(chóng)包囊即可感染此病，兒童、年老體弱者、免疫功能低下者、旅游者對(duì)本蟲(chóng)更易感。感染了賈第鞭毛蟲(chóng)的人及動(dòng)物為賈第鞭毛蟲(chóng)病的主要傳染源，動(dòng)物保蟲(chóng)宿主要包括有牛、馬、羊、豬、兔、如、貓、狗等。此外，很多野生動(dòng)物（如狼、美洲駝、河貍等）也可通過(guò)糞便排出具有感染性的包囊。

賈第鞭毛蟲(chóng)有多種感染途徑與傳播方式，其中水源傳播是傳播本蟲(chóng)的重要途徑。20世紀(jì)90年代，賈第鞭毛蟲(chóng)曾為美國(guó)7種經(jīng)水源傳播的原蟲(chóng)之首。另外，接觸傳播也是導(dǎo)致賈第鞭毛蟲(chóng)病流行或暴發(fā)的主要途徑。學(xué)校、幼兒園人群聚集的地方，以及家庭成員之間，人與人之間的密切接觸極其容易導(dǎo)致該蟲(chóng)在人群間傳播而感染發(fā)病。此外，通過(guò)飲食了含有污染有賈第鞭毛蟲(chóng)包囊的食物或飲料，或是飲用了不干凈的水都可感染賈第鞭毛蟲(chóng)病。

2 賈第鞭毛蟲(chóng)的流行因素

2.1 社會(huì)因素

賈第鞭毛蟲(chóng)的流行暴發(fā)在一定程度上與當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)及社會(huì)發(fā)展水平、人們的受教育程度、生活方式及衛(wèi)生意識(shí)等有著積極密切的關(guān)系。在經(jīng)濟(jì)發(fā)展落后，居住條件和公共衛(wèi)生條件差，老百姓衛(wèi)生意識(shí)落后的地區(qū)，賈第鞭毛蟲(chóng)病的流行就相對(duì)較為普遍。在許多貧窮落后的山區(qū)或是農(nóng)村地區(qū)，由于清潔供水系統(tǒng)不完善，飲水衛(wèi)生條件差，該類(lèi)地區(qū)經(jīng)常暴發(fā)經(jīng)飲水而傳播賈第鞭毛蟲(chóng)病。此外，從賈第鞭毛蟲(chóng)非流行區(qū)進(jìn)入流行區(qū)旅游的人、學(xué)校等集體生活的兒童或衛(wèi)生習(xí)慣差的兒童，賈第鞭毛蟲(chóng)的感染率也相對(duì)較高。

2.2 自然因素

賈第鞭毛蟲(chóng)感染流行的自然因素主要包括氣候條件（如氣溫、降水量、干濕度等）和經(jīng)緯度、海拔高度等地理因素。這些自然因素可直接影響到賈第鞭毛蟲(chóng)包囊在外界的存活時(shí)間和感染活力，從而影響賈第鞭毛蟲(chóng)病的流行和暴發(fā)。研究表明，氣溫與賈第鞭毛蟲(chóng)感染率呈顯著正相關(guān)關(guān)系。賈第鞭毛蟲(chóng)包囊對(duì)外界環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，在水中和涼爽環(huán)境中可存活數(shù)天至1月之久，在經(jīng)氯（0.5%）消毒的水中可存活2d～3d，在人活動(dòng)物體外排出的糞便中包囊的感染活力可維持10d以上。賈第鞭毛蟲(chóng)包囊對(duì)低溫有較強(qiáng)的耐受性，在4℃環(huán)境中可存活2個(gè)月以上，但在50℃以上高溫或干燥環(huán)境下抵抗力較弱易死亡。因此，在冷濕的季節(jié)，賈第鞭毛蟲(chóng)包囊在外界存活時(shí)間較長(zhǎng)，感染率也較高。此外，包囊在蒼蠅的消化道中可存活24h，在蟑螂消化道內(nèi)也可存活12d之久。由此，賈第鞭毛蟲(chóng)包囊也可能通過(guò)蒼蠅、蟑螂這類(lèi)節(jié)肢動(dòng)物體機(jī)械性的傳播方式間接傳染人類(lèi)。

3 賈第鞭毛蟲(chóng)病的危害

賈第鞭毛蟲(chóng)病為人體腸道感染的常見(jiàn)寄生蟲(chóng)病之一，常常引起腹瀉、腹痛和消化不良。賈第鞭毛蟲(chóng)感染導(dǎo)致的病變多累及十二指腸及空腸上段，嚴(yán)重者膽囊、膽管，回腸末端、闌尾、結(jié)腸，膜管，肝管等均可受到侵襲。若嚴(yán)重感染得不到及時(shí)治療，病程會(huì)持續(xù)很久，并可造成營(yíng)養(yǎng)吸收不良和兒童發(fā)育遲緩。另外，賈第鞭毛蟲(chóng)常與艾滋病合并感染而危機(jī)生命。

賈第鞭毛蟲(chóng)病呈全球性分布，在熱帶和溫帶，甚至寒帶地區(qū)都有流行或暴發(fā)。20世紀(jì)70年代和80年代，賈第鞭毛蟲(chóng)病的流行非常嚴(yán)重，該病不僅在發(fā)展中國(guó)家的流行，而且在美國(guó)、加拿大、英國(guó)、和澳大利亞等發(fā)達(dá)國(guó)也有暴發(fā)和流行。在我國(guó)賈第鞭毛蟲(chóng)也呈全國(guó)性分布態(tài)勢(shì)，北起黑龍江省南至海南島，西從西藏東到東南沿海，均有本病的存在和區(qū)域性的流行。

4 賈第鞭毛蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)

4.1 病原學(xué)檢測(cè)

病原學(xué)檢測(cè)賈第鞭毛蟲(chóng)是賈第鞭毛蟲(chóng)病確診的最直接的依據(jù)。生理鹽水直接涂片法、碘液包囊染色法、十二指腸引流液檢查法等都是通過(guò)涂片鏡檢賈第鞭毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體或包囊的最常用、最直接的確診方法。采集新鮮糞便做生理鹽水涂片或染色涂片后鏡檢，如果看到滋養(yǎng)體或包囊的存在，就可確診。但是因賈第鞭毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體對(duì)外界環(huán)境的抵抗力弱，在排出體外后數(shù)小時(shí)即死亡，為保持滋養(yǎng)體的活力，送檢的標(biāo)樣必須要求保溫儲(chǔ)藏和運(yùn)送。利用漂浮法檢測(cè)糞便樣品中的寄生蟲(chóng)是目前臨床上使用廣泛，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、較經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)技術(shù)。Claerebout E等［1］利用飽和蔗糖漂浮法富集賈第鞭毛蟲(chóng)包囊，成功對(duì)犬糞便樣本進(jìn)行賈第鞭毛蟲(chóng)檢測(cè)。但是該方法最大缺點(diǎn)是敏感性低，漏檢率高。因此，要想提高賈第鞭毛蟲(chóng)的檢出率，對(duì)使用該方法的操作者提出了更高的要求，整個(gè)操作過(guò)程必須需要專(zhuān)業(yè)水平高，臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員操作。除此之外，不斷優(yōu)化賈第鞭毛蟲(chóng)的濃縮、分離和染色方法和程序，采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)染色試劑和物理的機(jī)械振蕩方式，以及先進(jìn)的儀器設(shè)備可有效提高包囊的回收率和檢出率。

4.2 免疫學(xué)檢測(cè)

免疫學(xué)檢測(cè)方法由于其特異性好、敏感性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，易于推廣使用的有點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、生物領(lǐng)域有著不可替代的應(yīng)用前景，將免疫學(xué)方法成功應(yīng)用到對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)，開(kāi)辟了賈第鞭毛蟲(chóng)檢測(cè)的新途徑，并展現(xiàn)出良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。

在免疫學(xué)檢測(cè)中技術(shù)當(dāng)中，ELISA酶標(biāo)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用最普遍、適用范圍最廣。它具有特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性佳、高通量、耗時(shí)短、成本低等眾多優(yōu)勢(shì)。以藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)包囊為抗原，以新鮮采集的糞便樣本為檢測(cè)對(duì)象，借助酶標(biāo)抗體，通過(guò)酶促顯色的放大作用，可有效檢測(cè)出多種樣本中微量的賈第鞭毛蟲(chóng)包囊。Selim S等［2］對(duì)90份患者糞樣采用ELISA方法檢測(cè)賈第鞭毛蟲(chóng)，其中46份（51.1%）檢出為陽(yáng)性，靈敏度為97.3% ，特異度為82.6%。目前，國(guó)內(nèi)外均已有商業(yè)化的ELISA試劑盒廣泛用于對(duì)糞便等樣本中賈第鞭毛蟲(chóng)的有效檢測(cè)。

免疫熒光技術(shù)（immunofluorescent technique，IFT）也是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者檢測(cè)賈第鞭毛蟲(chóng)常用的方法之一。由于該法敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，因而在賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)中應(yīng)用非常廣泛。Geurden T等［3］曾用直接免疫熒光法對(duì)犬的糞便樣本進(jìn)行賈第鞭毛蟲(chóng)檢測(cè)，檢出率明顯提高。免疫熒光法可用于檢測(cè)抗原，也可用于檢測(cè)抗體。Guimaraes S等［4］曾采用間接免疫熒光法對(duì)147份0～6歲兒童的血樣進(jìn)行賈第鞭毛蟲(chóng)抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法具有較高的敏感性和特異性。此外，免疫熒光技術(shù)對(duì)水中賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)已經(jīng)成為目前國(guó)際上通用的金標(biāo)準(zhǔn)方法。余素華等［5］采用濾囊過(guò)濾、振蕩洗脫、離心濃縮、免疫磁珠分離富集賈第鞭毛蟲(chóng)包囊，然后采用免疫熒光染色和微分干涉相襯鏡檢計(jì)數(shù)相結(jié)合，成功檢測(cè)出水中的賈第鞭毛蟲(chóng)包囊，為城市用水的安全衛(wèi)生提供了技術(shù)保障。然而，免疫熒光法的關(guān)鍵是要預(yù)先充分準(zhǔn)備好針對(duì)不同靶抗原對(duì)應(yīng)的特異熒光抗體，而且實(shí)驗(yàn)室必須備有熒光顯微鏡等必須設(shè)備。因此，該方法的成本相對(duì)較高。

4.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

在對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的直接檢測(cè)中，對(duì)樣本中的包囊進(jìn)行富集濃縮、涂片鏡檢是最傳統(tǒng)、最經(jīng)典的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，許多日新月異的分子生物學(xué)快速診斷方法相繼被國(guó)內(nèi)外科技工作者研發(fā)并應(yīng)用。比如PCR方法、套式PCR方法、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）方法，多重?zé)晒釶CR、PCR-限制性片段多態(tài)分析（PCR-RFLP）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）等分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)都已經(jīng)成功應(yīng)用到對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)當(dāng)中。針對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的基因檢測(cè)技術(shù)已成為當(dāng)前所有賈第鞭毛蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)當(dāng)中最快速、最敏感的診斷方法之一。

4.3.1 PCR PCR技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來(lái)的一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)已用于賈第鞭毛蟲(chóng)臨床標(biāo)本和環(huán)境水樣的檢測(cè)，其優(yōu)點(diǎn)是敏感、特異，能分辨基因型，簡(jiǎn)便易行。Trout J M等［6］對(duì)狼的糞便利用PCR方法檢測(cè)糞樣中含有的賈第鞭毛蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)，首次報(bào)道了賈第鞭毛蟲(chóng)的多種基因型。Marangi M等［7］對(duì)意大利貧困地區(qū)的兒童糞便樣本和犬糞樣本采用PCR技術(shù)檢測(cè)賈第鞭毛蟲(chóng)感染情況，成功檢出5份兒童糞便和8份犬糞便樣本為賈第鞭毛蟲(chóng)陽(yáng)性，與傳統(tǒng)的糞便顯微鏡檢方法相比，PCR技術(shù)的敏感性大大提高。

4.3.2 套式PCR（nested-PCR） 套式PCR是指分別用兩套PCR引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，從極少量的模板中獲得較高濃度和純度的靶片段的擴(kuò)增技術(shù)。國(guó)外很多學(xué)者將套式PCR應(yīng)用到對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)和研究中，大大提高了賈第鞭毛蟲(chóng)檢測(cè)的敏感性和可靠性。Miller K M等［8］采用套式PCR對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)包囊進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該方法可有效檢測(cè)到單個(gè)賈第鞭毛蟲(chóng)包囊。Ghosh S等［9］設(shè)計(jì)了2對(duì)引物對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)rRNA的基因間隔區(qū)（intergenic spacer，IGS）進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，成功檢出少于2pg的賈第鞭毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體的DNA。而且在對(duì)糞便樣品進(jìn)行藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的直接診斷中，通過(guò)套式PCR擴(kuò)增IGS序列，顯示了更高的靈敏性和特異性，應(yīng)用該技術(shù)可檢測(cè)到100μL糞便樣本中的10個(gè)寄生蟲(chóng)原蟲(chóng)。

不僅如此，應(yīng)用套式PCR技術(shù)還可確定賈第鞭毛蟲(chóng)的基因型。Helmy M M等［10］根據(jù)賈第鞭毛蟲(chóng)的磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）基因，設(shè)計(jì)引物，建立套式實(shí)時(shí)PCR方法成功對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的兩個(gè)主要的基因型進(jìn)行檢測(cè)。Mahdy A K等［11］根據(jù)賈第鞭毛蟲(chóng)核糖體RNA小亞基基因序列，建立套式PCR檢測(cè)方法。應(yīng)用該技術(shù)，作者對(duì)馬來(lái)西亞某地區(qū)已通過(guò)三色染色法確定賈第鞭毛蟲(chóng)糞便包囊進(jìn)行基因分型研究。通過(guò)測(cè)序技術(shù)和進(jìn)化樹(shù)的繪制及分析，準(zhǔn)確鑒定出了當(dāng)?shù)刭Z第鞭毛蟲(chóng)流行的蟲(chóng)株基因型（B型）。

4.3.3 逆轉(zhuǎn)錄-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）是對(duì)RNA病毒進(jìn)行快速檢測(cè)的一種最常用的分子診斷技術(shù)。提取細(xì)胞或組織總RNA后在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，PCR擴(kuò)增cDNA基因便能達(dá)到檢測(cè)病原微生物的目的。該技術(shù)也被應(yīng)用到對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)。通常，對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的PCR檢測(cè)都針對(duì)染色體DNA進(jìn)行，但PCR的缺點(diǎn)是不能提供病原體的活性和感染性。由于染色體DNA在卵囊死后仍可能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保存完好，普通PCR往往能檢出無(wú)感染活性的卵囊。由于mRNA的半衰期非常短（幾秒鐘），與以DNA為基礎(chǔ)的其他檢測(cè)方法相比，mRNA更能準(zhǔn)確的反映機(jī)體的活性狀態(tài)。因?yàn)橹挥谢钚缘募?xì)胞才能產(chǎn)生mRNA，所以針對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的RT-PCR檢測(cè)技術(shù)正是基于檢測(cè)編碼熱激蛋白Hsp70（heat shock protein 70）的 mRNA來(lái)檢測(cè)具有感染活性的卵囊。該方法通過(guò)熱激賈第鞭毛蟲(chóng)卵囊，誘導(dǎo)其產(chǎn)生保護(hù)性的熱激蛋白mRNA，隨后立即抽提mRNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，用PCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)物，達(dá)到檢測(cè)的目的。Lee G C等［12］根據(jù)賈第鞭毛蟲(chóng)基因序列和生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)Hsp70引物，利用RT-PCR方法擴(kuò)增賈第鞭毛蟲(chóng)熱激蛋白70基因，以區(qū)別賈第鞭毛蟲(chóng)包囊的死活。研究表明，該技術(shù)靈敏度極高，在對(duì)包囊進(jìn)行熱處理（45℃，20min）后，可檢測(cè)到1個(gè)活包囊／100μL。由此可見(jiàn)，該技術(shù)在賈第鞭毛蟲(chóng)卵囊活性檢測(cè)中的巧妙應(yīng)用，打破了RT-PCR技術(shù)在寄生蟲(chóng)領(lǐng)域的應(yīng)用瓶頸，為該技術(shù)在生物領(lǐng)域的廣泛使用開(kāi)辟了新途徑，新思路。

4.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR） 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種被生物科技工作者廣泛使用的分子檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)的發(fā)明歸功于兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)：一是發(fā)現(xiàn)DNA Taq酶有從5′到3′外切酶活性，二是利用熒光能量傳遞技術(shù)構(gòu)建了雙標(biāo)記寡核苷酸探針，即TaqMan探針。在PCR過(guò)程中，這些熒光信號(hào)可以被探測(cè)器所“即時(shí)”捕獲。該方法的特異性由引物和探針的特異性所決定，只有在PCR過(guò)程中，探針退火到目標(biāo)片段才能發(fā)出熒光信號(hào)。國(guó)外很多學(xué)者等將熒光探針檢測(cè)技術(shù)與RTPCR技術(shù)相結(jié)合，建立了實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，使得對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)的靈敏性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)顯微鏡檢測(cè)方法。

Bruijnesteijn van Coppenraet L E 等［13］應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)單次收集的糞便樣本進(jìn)行阿米巴蟲(chóng)，賈第鞭毛蟲(chóng)，隱孢子蟲(chóng)的多重聯(lián)合檢測(cè)，同時(shí)與分三次連續(xù)收集糞便樣品進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì) 。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在397份患者的糞便樣本中檢出152例（38.3%）陽(yáng)性病例，其中18個(gè)樣本為雙重感染。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法使得臨床檢出率提高了18%，而且結(jié)果證明，在臨床試驗(yàn)中一個(gè)單一的糞便樣本就可滿(mǎn)足完整的寄生蟲(chóng)學(xué)的診斷。無(wú)獨(dú)有偶，Ten Hove R J等［14］也曾對(duì)人糞便樣本進(jìn)行溶組織阿米巴，賈第鞭毛蟲(chóng)，隱孢子蟲(chóng)和糞類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng)的感染情況進(jìn)行檢測(cè)分析和評(píng)估，并將日常檢測(cè)使用的顯微鏡檢和抗原檢測(cè)結(jié)果與建立的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)溶組織阿米巴、賈第鞭毛蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)和糞類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng)的檢出率大大提高。Calderaro A等［15］對(duì)2006年-2008年收集386個(gè)患者的771份糞樣本進(jìn)行常規(guī)檢查和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，并對(duì)其敏感性和特異性進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢出了195份陽(yáng)性樣本，比常規(guī)顯微鏡檢查（金標(biāo)方法）多26份陽(yáng)性，其靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均為100%。Helmy M M等［10］對(duì)收集的97份人糞樣本進(jìn)行賈第鞭毛蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，41份樣本為陽(yáng)性（42.3%），敏感性極高。由此可見(jiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法是一種非常敏感、高效、實(shí)用的快速檢測(cè)技術(shù)，它不僅可完成高通量的檢測(cè)，同時(shí)也大大降低了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的工作量。

4.3.5 多重Real-time PCR 將幾對(duì)引物集聚在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系內(nèi)，同時(shí)對(duì)指定樣本進(jìn)行擴(kuò)增，達(dá)到一步法檢測(cè)不同種類(lèi)的寄生蟲(chóng)或同一種類(lèi)寄生蟲(chóng)的不同基因型的目標(biāo)，這一技術(shù)稱(chēng)為多重PCR。

賈第鞭毛蟲(chóng)、溶組織阿米巴蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)是3種最重要的導(dǎo)致腹瀉的寄生原蟲(chóng)。多年來(lái)，顯微鏡檢查糞便樣本被認(rèn)為是溶組織阿米巴、賈第鞭毛蟲(chóng)和隱孢子感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，雖然PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和直接熒光抗體檢測(cè)方法已被引入三種寄生蟲(chóng)感染的診斷，但以上相對(duì)獨(dú)立的檢測(cè)方法用于對(duì)每一種寄生蟲(chóng)檢測(cè)，合計(jì)起來(lái)費(fèi)時(shí)、花費(fèi)高、消耗大。應(yīng)用多重PCR技術(shù)則可有效解決以上問(wèn)題。Haque R等［16］建立了多重Real-time PCR，在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中采用種特異性探針?lè)謩e對(duì)溶組織阿米巴、賈第鞭毛蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒別檢測(cè)，并將建立的方法在臨床標(biāo)本進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，該方法具有相當(dāng)高的敏感性（89%）和特異性（99%）。該方法不僅可對(duì)以上3種寄生原蟲(chóng)進(jìn)行一步法檢測(cè)，同時(shí)該方法也可單獨(dú)用于檢測(cè)某種寄生蟲(chóng)。Ten Hove R J等［14］利用多重 Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)了2 591份糞便中的阿米巴、賈第鞭毛蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)和類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng)，與傳統(tǒng)鏡檢檢測(cè)方法進(jìn)行比較，敏感性明顯提高。

不僅如此，應(yīng)用多重Real-time PCR技術(shù)還可對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的基因型進(jìn)行分型檢測(cè)研究。Eligio-Garcia L等［17］利用多重Real-time PCR對(duì)24份已知的賈第鞭毛蟲(chóng)陽(yáng)性糞便樣本進(jìn)行分型基因檢測(cè)。結(jié)果顯示，18份為A1型，4份為A2型，1份為A1和A2混合型感染，1份為G型。多重Real-time PCR方法的應(yīng)用，不僅方便快捷，而且省時(shí)間、低消耗，未來(lái)的臨床應(yīng)用前景非常廣闊。

4.3.6 PCR-限制性片段多態(tài)性分析 PCR-限制性片段多態(tài)性分析（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）是一種通過(guò)設(shè)計(jì)保守引物，PCR擴(kuò)增某些基因片段，然后用特定的限制性?xún)?nèi)切酶酶切，觀察其酶切片段差異，進(jìn)而準(zhǔn)確鑒定不同種或不同基因型的現(xiàn)代分子技術(shù)。Helmy M M等［10］采用套式熒光PCR-RFLP技術(shù)對(duì)發(fā)生急性腹瀉人群的糞便樣本進(jìn)行賈第鞭毛蟲(chóng)的磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）基因分析。該方法成功揭示了當(dāng)?shù)匕l(fā)生腹瀉人群受賈第鞭毛蟲(chóng)感染嚴(yán)重，并對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的基因型進(jìn)行了鑒別。該技術(shù)不僅能從新鮮糞便樣本中檢測(cè)到賈第鞭毛蟲(chóng)，而且指出當(dāng)?shù)亓餍械幕蛐图白钜赘腥巳旱哪挲g。Ajjampur S S等［18］對(duì)南印度地區(qū)城市貧民窟居民的發(fā)生急性腹瀉的兒童進(jìn)行賈第鞭毛蟲(chóng)感染調(diào)查，并對(duì)50份有腹瀉癥狀兒童的陽(yáng)性糞樣和51份無(wú)癥狀的兒童陽(yáng)性糞樣進(jìn)行磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的PCR-RFLP分析。結(jié)果顯示50份有腹瀉癥狀的兒童的陽(yáng)性糞便中，40份基因型為B型，5份為A2型，5份為B和A2混合感染；51份無(wú)癥狀的兒童陽(yáng)性糞樣中，48份基因型為B型，2份集聚體A2型，1份為B型和A2型混合感染。由于PCR-RFLP方法快速簡(jiǎn)便、成本較低，而且對(duì)樣品的純度要求不高，因此具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值和前景。

4.3.7 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種非常簡(jiǎn)潔和方便的基因擴(kuò)增方法。通過(guò)該技術(shù)能實(shí)現(xiàn)在15min～60min內(nèi)，將目標(biāo)基因擴(kuò)增109～1010倍，這是所有其他基因擴(kuò)增方法無(wú)法比擬的。也正是因?yàn)長(zhǎng)AMP方法靈敏度極高，能實(shí)現(xiàn)樣品前處理簡(jiǎn)單化的目標(biāo)。如此高效率地?cái)U(kuò)增，產(chǎn)物量多到我們直接肉眼就能鑒別結(jié)果（反應(yīng)中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂，可以肉眼判斷結(jié)果），省去了其他基因擴(kuò)增方法后續(xù)結(jié)果檢測(cè)的步驟。該技術(shù)依賴(lài)于能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增靶序列。國(guó)外學(xué)者Plutzer J等［19］首次將LAMP技術(shù)應(yīng)用到對(duì)賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)，并對(duì)該技術(shù)與傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行比對(duì)。作者利用LAMP技術(shù)對(duì)35份糞便和水樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中檢出陽(yáng)性樣本24份，比常規(guī)PCR檢出陽(yáng)性樣本多1份；LAMP的特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法能特異擴(kuò)增賈第鞭毛蟲(chóng)集聚體A和B 2個(gè)基因型，而不能擴(kuò)增其他寄生蟲(chóng)。與PCR和Real-time PCR方法相比，LAMP是一種重復(fù)性好、靈敏性高、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)省錢(qián)的賈第鞭毛蟲(chóng)快速檢測(cè)方法。Plutzer J等［20］應(yīng)用LAMP方法并借助PCR測(cè)序技術(shù)，對(duì)2008年2月至3月期間匈牙利特定區(qū)域內(nèi)132只水鳥(niǎo)的糞便樣本進(jìn)行賈第鞭毛蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)，結(jié)果表明，在自然環(huán)境中，水鳥(niǎo)在隱孢子蟲(chóng)和賈第鞭毛蟲(chóng)的散播和區(qū)域性流行中起到一定的作用。我國(guó)學(xué)者盧濰媛等［21］根據(jù)GenBank賈第鞭毛蟲(chóng)基因序列及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理，設(shè)計(jì)4條賈第鞭毛蟲(chóng)特異引物，利用LAMP檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)DNA。LAMP產(chǎn)物經(jīng)SYBR green I顯色反應(yīng)，對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果成功檢測(cè)到體外培養(yǎng)的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)滋養(yǎng)體。雖然LAMP法引物設(shè)計(jì)比較復(fù)雜，但與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便快速、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，因此為臨床檢測(cè)賈第鞭毛蟲(chóng)提供了一種快速、簡(jiǎn)便的新方法 。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，賈第鞭毛蟲(chóng)病為人體腸道感染的最常見(jiàn)寄生蟲(chóng)病之一，常常引起腹瀉、腹痛和消化不良，對(duì)人體健康的危害嚴(yán)重。賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)技術(shù)多樣，但各有優(yōu)缺點(diǎn)。用顯微鏡對(duì)人的糞便進(jìn)行鏡檢已經(jīng)成為診斷賈第鞭毛蟲(chóng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，當(dāng)用該法對(duì)糞便樣本進(jìn)行顯微鏡鏡檢時(shí)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，勞動(dòng)強(qiáng)度大，檢出率低，敏感性不高。免疫學(xué)檢測(cè)法雖然大大提高了敏感性，但它對(duì)抗原要求較高，且很難區(qū)分包囊的活性。

現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)以其敏感性好、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)短等眾多優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到青睞，基因的分子檢測(cè)也將賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)技術(shù)提高到了新的臺(tái)階。分子生物學(xué)檢測(cè)方法的建立極大地大縮短了賈第鞭毛蟲(chóng)檢測(cè)時(shí)間，也逐漸被越來(lái)越多的科研人員應(yīng)用和改進(jìn)。PCR及其衍生技術(shù)的應(yīng)用極大地提高了賈第鞭毛蟲(chóng)的檢出率，尤其是Real-time PCR方法敏感性極高，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)已成為當(dāng)前所有賈第鞭毛蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)當(dāng)中最快速、最敏感的方法之一，具有很好的發(fā)展前景。

然而，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，盡管由于賈第鞭毛蟲(chóng)DNA交叉污染的情況出現(xiàn)，但相比而言它的特異性仍然較低，很多陽(yáng)性樣本無(wú)法檢出。因此，在實(shí)際工作中，對(duì)糞便樣本進(jìn)行賈第鞭毛蟲(chóng)檢驗(yàn)和鑒定，顯微鏡檢查仍是首選，這主要是因?yàn)樗軌蛲瑫r(shí)檢測(cè)除賈第鞭毛蟲(chóng)以外的其他胃腸道寄生蟲(chóng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及LAMP技術(shù)因具有較高的敏感性，因而常用于顯微鏡檢查的替代方法，或大量樣本檢測(cè)的初篩工具，在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用非常廣泛。我們有理由相信，隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，賈第鞭毛蟲(chóng)的檢測(cè)方法也會(huì)越來(lái)越完善，以便將賈第鞭毛蟲(chóng)的危害降到最低。

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