董書偉，李 巍，嚴(yán)作廷，王旭榮，高昭輝，荔 霞＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室／甘肅省中獸藥工程技術(shù)中心，甘肅蘭州730050；2.鄭州牧業(yè)高等?？茖W(xué)校，河南鄭州450000；3.甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實驗室，甘肅蘭州730050）

隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；图s化發(fā)展，口蹄疫、結(jié)核病和布魯氏菌病等傳染病已經(jīng)得到了有效的控制，而蹄病作為奶牛的常見病，卻成為了危害奶牛生產(chǎn)的三大疾病之一。據(jù)報道［1］，我國每年因蹄病被迫過早淘汰的奶牛占總淘汰頭數(shù)的15%～30%，給奶牛業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)2 250萬元。李玉文等［2］調(diào)查了唐山市奶牛發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)因患乳房炎而被淘汰的奶牛占到32%，因患蹄病而被淘汰的奶牛占到21.5%，由此可見，蹄病對奶牛生產(chǎn)的影響僅次于乳房炎，已成為當(dāng)?shù)匾鹉膛Ｌ蕴疃嗟牡诙蠹膊　?/p>

蹄葉炎是奶牛最為常見的一種蹄病，41%的蹄病是蹄葉炎，72%的奶牛至少有一個蹄發(fā)生過此?。?］。據(jù)楊前鋒調(diào)查［4］，豫北某奶牛場在春夏季蹄葉炎發(fā)病率高達(dá)18%，可見奶牛蹄葉炎發(fā)病率較高。由于蹄葉炎可導(dǎo)致奶牛蹄變形，蹄底潰瘍及白線病等多種蹄病，引起奶牛疼痛不安，嚴(yán)重影響了奶牛福利，導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能明顯下降［5］，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，制約了奶業(yè)的健康發(fā)展，因此，對該病開展病因、發(fā)病機(jī)理、診斷和防治等方面的研究，為控制奶牛蹄葉炎，提高奶牛生產(chǎn)性能和改善動物福利，具有重要的實用價值和現(xiàn)實意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)是生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時代的重要標(biāo)志，已成為生命科學(xué)研究的重要技術(shù)手段，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的多項領(lǐng)域［6］。因此，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究奶牛蹄葉炎，能進(jìn)一步在蛋白水平揭示其發(fā)病機(jī)制，為該病的診斷與治療提供新的理論依據(jù)，并為其防治藥物的研發(fā)提供新思路，開辟新途徑。本文綜述了奶牛蹄葉炎的主要研究進(jìn)展，并探討了蛋白質(zhì)組學(xué)在該病研究中的應(yīng)用前景和價值。

1 奶牛蹄葉炎的研究現(xiàn)狀

1.1 奶牛蹄葉炎的病因

奶牛蹄葉炎是蹄壁真皮乳頭層和血管層的彌漫性、漿液性、非化膿性炎癥［7］。由于蹄葉炎發(fā)生多呈慢性經(jīng)過，從表面上看不出對奶牛生產(chǎn)和繁殖性能的影響，因此，未引起飼養(yǎng)管理者的足夠重視，致使蹄葉炎成為奶牛的一個隱形殺手。

長期以來，普遍認(rèn)為奶牛蹄葉炎是機(jī)體代謝紊亂的局部表現(xiàn)［7］；乳酸、內(nèi)毒素和組織胺是誘發(fā)該病的主要因素［8-9］。但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，蹄葉炎是由綜合因素所致，包括日糧中碳水化合物過多、疾病、遺傳和管理等多種因素［10］。蹄形不正，如高蹄、低蹄、過長蹄等，使蹄的機(jī)能發(fā)生障礙，影響蹄部血液循環(huán)也會誘發(fā)本病；還有蹄葉炎繼發(fā)于瘤胃酸中毒、胎衣不下、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、酮病等［11］。另外，管理不善也會誘發(fā)蹄葉炎，包括圈舍條件，特別是地面質(zhì)量、有無墊草及奶牛運(yùn)動量等［12］。奶牛妊娠后期，后肢水腫，使蹄部真皮層的抵抗力降低；持續(xù)而不合理的過度負(fù)重；甲狀腺機(jī)能減退等都可能是誘發(fā)本病的因素。

1.2 奶牛蹄葉炎的發(fā)病機(jī)制

由于蹄葉炎的病因比較繁雜，其發(fā)病機(jī)理也尚無定論，因此，截止目前，還沒有成功建立起公認(rèn)的奶牛蹄葉炎病理模型［13］。但是，在發(fā)病機(jī)理方面比較普遍的觀點(diǎn)是：蹄部組織由于血液回流阻力大和久負(fù)重體，再加上血管活性物質(zhì)的共同作用，引起蹄組織毛細(xì)血管充血、淤血，血液回流受阻，導(dǎo)致蹄局部微循環(huán)障礙，蹄組織供氧不足，代謝紊亂，使蹄組織處于 “臨界應(yīng)激”狀態(tài)，極易發(fā)生蹄葉炎［3，14］。Morgan S J等［15］通過觀察蹄葉炎組織病理學(xué)的變化，發(fā)現(xiàn)單層上皮黏膜受損，趾間血管的血液灌注量不足，鱗狀細(xì)胞分離和退化，真皮層毛細(xì)血管內(nèi)存在血栓和脈管炎，這可能是導(dǎo)致蹄葉炎的潛在原因。

近年來，很多學(xué)者開始關(guān)注金屬蛋白酶對基底膜的破壞作用，發(fā)現(xiàn)蹄部薄膜組織結(jié)構(gòu)中存在有金屬蛋白酶MMPs，能催化降解蹄部許多重要的組織結(jié)構(gòu)，如基底膜（BM）、半細(xì)胞橋粒（上皮細(xì)胞膜中的局部增厚組織），最終使BM和基部上皮細(xì)胞分離，使組織結(jié)構(gòu)喪失生物學(xué)功能，在機(jī)體健康情況下，這些金屬酶處于鈍化態(tài)，不具有催化活性。當(dāng)有大量的微生物代謝毒素時，這些酶被激活，從而引起薄膜組織結(jié)構(gòu)的損傷［16-17］。含血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶 （ADAMTS）也有相同的作用，迄今共發(fā)現(xiàn)有19個金屬蛋白酶成員，它們在維持凝血系統(tǒng)的穩(wěn)定、器官生成、炎癥和發(fā)育等方面有重要作用，其中ADAMTS-4和ADAMTS-5在哺乳動物關(guān)節(jié)炎炎癥中起關(guān)鍵作用［18］。試驗證明［19］，幾種細(xì)菌內(nèi)毒素可不同程度的激活MMP-2和MMP-9，雖然ADAMTS-4和ADAMTS-5的激活機(jī)制還不清楚，但是，MMP-2和ADAMTS-5在降解細(xì)胞外基質(zhì)中可能起關(guān)鍵作用［20］。當(dāng)奶牛采食大量精料時，瘤胃中以牛鏈球菌為主的有害菌，能在充足的底物、較低的pH環(huán)境中迅速繁殖為優(yōu)勢菌株，將碳水化合物降解為以L-乳酸為主的酸類，而細(xì)菌自身代謝的內(nèi)毒素和其他血管活性物質(zhì)則通過血液循環(huán)，激活蹄部真皮毛細(xì)血管壁中的金屬蛋白酶，使血管壁的通透性增強(qiáng)，也可引起紅細(xì)胞和血小板凝聚，形成血栓；使生角質(zhì)細(xì)胞發(fā)生營養(yǎng)供應(yīng)不足，從而合成角質(zhì)出現(xiàn)障礙［21］。另一方面，瘤胃內(nèi)乳酸含量升高，pH下降，在多種細(xì)菌作用下，組氨酸脫羧，產(chǎn)生大量的組胺，作用于蹄部真皮，引起淋巴停滯、嚴(yán)重充血和血管損傷，最終引起蹄葉炎［22］。

經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者幾十年的堅持不懈的努力研究，在奶牛蹄葉炎的病因和發(fā)病機(jī)理方面都做了大量的工作，但是，至今其發(fā)病機(jī)理尚無定論，并且大多數(shù)研究都僅僅關(guān)注組織中單個致病因素，而沒有從整體上系統(tǒng)的篩選，不足于深入認(rèn)識 “蹄葉炎是全身代謝紊亂的局部表現(xiàn)”，那么，奶牛發(fā)生蹄葉炎后，機(jī)體內(nèi)的全部蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了什么樣的變化？這些變化之間又存在著怎樣的聯(lián)系？它們在蹄葉炎的發(fā)生發(fā)展過程中起著怎樣的作用呢？截至目前，國內(nèi)外尚未見到類似研究和報道。研究這些關(guān)鍵科學(xué)問題，是擺在我們科研工作者面前的巨大挑戰(zhàn)。如今，傳統(tǒng)的科研方法對研究蹄葉炎這一復(fù)雜疾病已有點(diǎn)力不從心，那么借助新興的科學(xué)技術(shù)和方法，從嶄新的視角去審視這一頑固的疾病，另辟蹊徑，或許會給我們提供新的思路。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究現(xiàn)狀

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容

蛋白質(zhì)組于1994年由Wilkins和Williams提出［23］，是指一種細(xì)胞、組織或機(jī)體在特定的生理或病理時期，表達(dá)的全部蛋白質(zhì)整體；蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對象，在整體水平上研究所有蛋白質(zhì)的組成、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系及其變化規(guī)律的學(xué)科［24］。其主要研究內(nèi)容有：①功能蛋白質(zhì)組學(xué)：鑒定某個體系的蛋白質(zhì)組所有組分，并闡述其修飾特性及功能；②差異蛋白質(zhì)組學(xué)，即比較蛋白質(zhì)組學(xué)：以重要生理現(xiàn)象或疾病為對象，比較細(xì)胞或機(jī)體在生理和病理過程中的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，尋找疾病的特異性標(biāo)志蛋白或新的藥物靶標(biāo)，為重大疾病的發(fā)病機(jī)理、早期診斷和防治提供理論和物質(zhì)基礎(chǔ)［25］，也為篩選藥物靶標(biāo)分子提供了新的思路；③相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)：利用多項技術(shù)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，繪制某個體系內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用和聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)圖譜［26］。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)有基于凝膠技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)兩大類，包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)和生物信息學(xué)分析，其特點(diǎn)是采用高分辨率的蛋白質(zhì)分離方法和高通量的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，全景式地展現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，研究蛋白質(zhì)組中功能分類與驗證，從而闡明重要現(xiàn)象的分子機(jī)制等［27］。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本步驟包括蛋白質(zhì)樣品制備、分離、鑒定和生物信息學(xué)分析。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、微生物學(xué)和農(nóng)學(xué)等研究領(lǐng)域，取得了可喜的進(jìn)展。通過比較病變組織與正常組織或疾病不同發(fā)展階段的組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，尋找與疾病相關(guān)的特異蛋白質(zhì)，為研究疾病的早期診斷、生物標(biāo)志物、新藥靶標(biāo)和分子發(fā)病機(jī)制提供線索［28］。Lee I等［29］利用蛋白組學(xué)技術(shù)研究慢性丙型肝炎，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體蛋白過高表達(dá)，認(rèn)為其可作為與該型肝炎相關(guān)的特異性蛋白標(biāo)志物。Huang Z等［30］比較了食管癌及癌旁組織的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在癌組織中磷酸丙糖異構(gòu)酶、錳超氧化物歧化酶和熱休克蛋白表達(dá)上調(diào)，而鱗狀細(xì)胞癌抗原、細(xì)胞角蛋白和膜聯(lián)蛋白表達(dá)下調(diào)，該結(jié)果為闡明食管癌的發(fā)生機(jī)制提供了線索，也為尋找食管癌潛在標(biāo)志物奠定了理論基礎(chǔ)。另外，通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究藥物的毒理作用機(jī)制，尋找毒性的蛋白標(biāo)志物，以此預(yù)測或評價藥物的毒性，對新藥研發(fā)和早期預(yù)測在的毒性作用具有重要意義。Yamamoto T等［31］用2-DE-MS方法比較了4種肝毒性藥物（對乙酰氨基酚、胺碘酮、四環(huán)素和四氯化碳）干預(yù)后的肝組織蛋白表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)CA3、HSP60、AK4等8種蛋白在肝損傷組織中均發(fā)生改變，發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)表達(dá)模式的變化與血液生化指標(biāo)及組織病理等傳統(tǒng)的毒性評價結(jié)果一致，說明蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物先導(dǎo)化合物的毒性篩選中具有重要的指導(dǎo)作用。

迄今，國內(nèi)外學(xué)者利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已在白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、腎癌和神經(jīng)母細(xì)胞癌等重大疾病研究方面進(jìn)行了大量的探索，發(fā)現(xiàn)了1 500多個潛在的新的疾病蛋白標(biāo)志物［32］，為腫瘤的發(fā)病機(jī)理、早期診斷、新藥篩選和療效判定提供了重要物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。由此可見，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域簡單、快速、得力的研究工具。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在奶牛蹄葉炎研究中的應(yīng)用

3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在獸醫(yī)科研中的應(yīng)用

雖然蛋白質(zhì)組學(xué)在生命科學(xué)研究中取得了可喜的成績，但在獸醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用卻是剛剛起步［33］，主要集中在病原與宿主相互作用的機(jī)制研究，以期篩選病原的致病或耐藥機(jī)制相關(guān)蛋白和疫苗候選抗原或藥物靶標(biāo)。如盧占軍［34］對馬立克病病毒（MDV）感染SPF雞后不同感染階段的法氏囊組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，提出載脂蛋白ApoaI持續(xù)的過量表達(dá)可能與MDV粒子跨膜感染機(jī)制有關(guān)，同時以ApoaI過表達(dá)為主導(dǎo)的脂類代謝紊亂可能是最終導(dǎo)致MDV感染易引起動脈粥樣硬化的主要原因。Sun J F等［35］應(yīng)用2D-DIGE技術(shù)分析豬感染豬瘟病毒強(qiáng)毒后，其血清蛋白質(zhì)組表達(dá)發(fā)生變化，發(fā)現(xiàn)4種蛋白表達(dá)上調(diào)，6種蛋白表達(dá)下調(diào)，功能涉及血管生成、血凝機(jī)制和抗炎途徑。劉永杰等［36］首次研究了Asia 1型口蹄疫病毒（FMDV）感染BHK-21細(xì)胞后蛋白質(zhì)組學(xué)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染組細(xì)胞蛋白表達(dá)上調(diào)251個點(diǎn)，下調(diào)221個點(diǎn)，新合成蛋白點(diǎn)30個，為揭示該病毒侵入細(xì)胞的分子機(jī)制提供了線索。楊艷玲等［37］應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)和Western blot方法，篩選羊布魯菌膜蛋白的候選抗原，發(fā)現(xiàn)12種蛋白能夠被牛、羊兩種血清共同識別，涉及布魯菌的能量代謝，蛋白合成，脂肪酸代謝及糖和輔酶的合成等生理過程，為研制布魯菌亞單位疫苗提供了候選抗原。由此可見，將蛋白質(zhì)組學(xué)策略引入獸醫(yī)科研中，為一些重大復(fù)雜疾病的防控研究開辟了新思路，提供了新的線索。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在奶牛蹄葉炎研究中的應(yīng)用

蹄葉炎是奶牛全身代謝紊亂的局部表現(xiàn)［7］，因此，奶牛發(fā)生蹄葉炎后，其血漿蛋白組必定發(fā)生相應(yīng)的變化，開展血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究，尋找并鑒定疾病發(fā)生過程中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，為發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物、藥物作用靶點(diǎn)和闡明疾病發(fā)生機(jī)理提供了新思路［38］。Andersson L等［39］研究了74例臨床蹄葉炎奶牛血清中蛋白的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)γ-球蛋白和α-球蛋白呈現(xiàn)明顯的變化。但是，蛋白質(zhì)組學(xué)在奶牛蹄葉炎研究中的應(yīng)用尚未見報道，筆者在2012年2月25日在PubMed文獻(xiàn)資源庫中進(jìn)行了檢索，在“題目／摘要”范疇內(nèi)，以“蛋白質(zhì)組學(xué)”、“蛋白質(zhì)組學(xué)和?！薄ⅰ暗鞍踪|(zhì)組學(xué)和蹄葉炎”為檢索詞，分別檢出40724、102、1篇論文，將“蛋白質(zhì)組學(xué)”、“?！焙汀疤闳~炎”等主題詞聯(lián)合檢索時，其結(jié)果為“0”。而在馬蹄葉炎的研究上，Johnson P J等［40］為了尋找基質(zhì)金屬蛋白酶MMP對蹄小葉基底膜降解的標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)蹄葉炎馬血清中Ⅳ型膠原蛋白含量顯著高于健康馬。Hannah G H等［41］采用蛋白組學(xué)方法研究馬蹄葉炎的蹄部組織時，發(fā)現(xiàn)37個蛋白表達(dá)上調(diào)，而22個蛋白表達(dá)下調(diào)，并且認(rèn)為差異表達(dá)的軟骨基質(zhì)蛋白（COMP）和角蛋白會被進(jìn)入血液，從而可能作為生物標(biāo)志物用來判斷馬蹄葉炎的發(fā)展階段。因此，將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到奶牛蹄葉炎的研究中，必定也會帶來新的發(fā)現(xiàn)。

4 展望

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)不論在基礎(chǔ)理論還是在技術(shù)方法上，都在不斷成熟和完善，并與其他學(xué)科的交叉合作也日益加強(qiáng)，如蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和生物信息學(xué)等領(lǐng)域的結(jié)合，呈現(xiàn)出嶄新的系統(tǒng)生物學(xué)研究模式，其整體性研究為特征的學(xué)術(shù)思想為研究那些復(fù)雜的疾病提供了全新的思路。盡管蛋白質(zhì)組學(xué)還是一門新興的學(xué)科，但隨著科學(xué)技術(shù)日新月異的發(fā)展，不斷涌現(xiàn)出新的蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)，如毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）、二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等，使之對復(fù)雜的蛋白質(zhì)體系進(jìn)行高分辨率的分離及高成功率的鑒定成為可能，極大地促進(jìn)了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展及其在其他學(xué)科中的應(yīng)用。如今，蛋白質(zhì)組學(xué)在生物醫(yī)學(xué)研究中已逐步顯示出其巨大的應(yīng)用價值和前景，已經(jīng)成為人類進(jìn)行生命科學(xué)研究最強(qiáng)有力的手段。

在奶牛蹄葉炎研究中，應(yīng)用蛋白組學(xué)策略研究奶牛血漿或組織中蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化，不僅可進(jìn)一步揭示奶牛蹄葉炎的發(fā)生機(jī)制，為蹄葉炎的早期防治提供新途徑，而且可豐富和補(bǔ)充奶牛蹄葉炎的病因?qū)W和發(fā)展階段理論，提高我國奶牛疾病的研究水平。因此，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究奶牛蹄葉炎具有重要的理論意義與實用價值，相信在不久的將來，我們會利用這些先進(jìn)的學(xué)術(shù)思想和科學(xué)技術(shù)，破解奶牛蹄葉炎研究中現(xiàn)存的科學(xué)之謎。

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