沈武玲，喬自林，令世鑫，馮玉萍，馮若飛，李明生，林學(xué)仕，柏家林，王家敏，馬忠仁＊

（1.甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030；3.甘肅省永靖縣畜牧局，甘肅永靖 731600）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）又稱豬藍耳病，是20世紀80年代末暴發(fā)的一種新型傳染病。1987年美國首次報道了該病的發(fā)生，當時稱之為豬神秘?。∕ystery swine disease，MSD），主要癥狀是妊娠母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊胎、弱仔等。隨后，該病迅速蔓延至歐洲養(yǎng)豬國家，一場空前的流產(chǎn)風(fēng)暴造成了100萬頭豬的死亡，使歐美國家的養(yǎng)豬業(yè)蒙受了災(zāi)難性的經(jīng)濟損失。1991年荷蘭學(xué)者Wensvoort G等［1］在Lelystad研究所用豬肺泡巨噬細胞（PAM）首次分離到病毒，并命名為Lelystad virus（LV），在第10次國際病毒大會上將該病毒歸屬于新設(shè)立的動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬。20世紀90年代中期該病蔓延至亞太地區(qū)，我國于1995年底在華北地區(qū)規(guī)模化豬場首先暴發(fā)和流行，1996年郭寶清等［2］采用間接免疫熒光法（IFA）從繁殖障礙豬群中證實本病在國內(nèi)的存在，并用豬巨噬細胞和Marc－145細胞成功分離了豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）。2006年4月，以仔豬高死亡率為特征的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征在我國南方部分省、市暴發(fā)，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的損失［3］。2008年6月，曾報道該病在湖南部分地區(qū)暴發(fā)，呈地方流行性［4］。2010年上半年在我國部分地區(qū)發(fā)生了以商品豬和母豬死亡率上升為主的所謂"高熱病"，甚至在有些地區(qū)商品豬的死亡率超過50%，母豬的死亡率也高達5% 以上［5］。該病已在很多省市豬群流行，已成為規(guī)?；B(yǎng)豬場繁殖障礙的主要病因。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病，我國將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征列為二類動物傳染病。

豬繁殖與呼吸綜合征的流行特點及其病原特性決定了該病一旦在豬群中出現(xiàn)，將很快通過空氣和接觸及人工授精等途徑傳播開來，特別是在規(guī)?；?、集約化、現(xiàn)代化的高密度養(yǎng)豬地區(qū)，該病傳播尤為迅猛，經(jīng)濟損失更為嚴重。疫苗的研究和使用是目前預(yù)防本病的最主要手段。

1 病原

繼Wensvoort等分離到Lelystad virus（LV），歐、美、日學(xué)者也相繼從表現(xiàn)PRRS類似癥狀的病豬中分 離 到 VR－2332、IAF－exp91 和IAF－klop 等 毒株，目前國際上將這些毒株通稱為PRRSV。PRRSV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒粒子直徑50nm～65nm，核衣殼25nm～35nm，表面有明顯的長約5nm的纖突，核衣殼呈立體對稱的二十面體。PRSSV有2個血清型，即美洲型和歐洲型，代表株分別為VR－2332株和LV株，2個毒株間氨基酸的同源性為78% ～81%，我國流行的PRRSV均屬于美洲型毒株［6］。最近，在東歐發(fā)現(xiàn)了與歐洲株屬于不同亞型的高致病性毒株，并將其命名為Lena。該病毒的基因組長約15kb，有9個開放閱讀框，分別為 ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和 ORF7［7］，病毒基因組相鄰的編碼框有部分重疊，有帽子結(jié)構(gòu)和poly（A）尾。ORF1a和 ORF1b位于基因組的3′端，長約12kb，占整個基因的75%。ORF2～ORF7在基因組的5′端，ORF2a、ORF2b、ORF3和 ORF4分別編碼病毒次要結(jié)構(gòu)蛋白 GP2a、GP2b、GP3、GP4，ORF5、ORF6和 ORF7分別編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，即囊膜蛋白 （GP5或E蛋白），基質(zhì)蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。GP5有6個抗原決定簇，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性中和抗體［8］；M蛋白是非糖基化蛋白，在所有PRRSV株間具性高度保守性，被認為與病毒宿主細胞受體相互作用有關(guān)。N蛋白在病毒粒子中含量較高，約占病毒蛋白總量的20%～40%，免疫原性極強，可用于PRRSV感染的早期檢測［9－10］。與所有的 RNA 病毒一樣，PRRSV 具有高度的變異性［11］，易形成一個異種群，近年來，PRRSV已向高致病性趨勢演化［12］。2006年夏季，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征先是從江西省發(fā)病，而后蔓延至周邊各省份［13］。

2 滅活疫苗

PRRS滅活疫苗是研制較早的疫苗，1997年Bayer公司就推出了滅活疫苗PRRomiSeTM。目前，國內(nèi)外已有多種針對美洲型PRRSV株 （CH－1a、ISU－P、JXA1、VD－A1）與歐 洲 型 PRRSV 株（LV、VD－E1、VD－E2）的商品化滅活疫苗，這些疫苗免疫動物都能很好地抵御來自疫苗同源強毒株的攻擊［14］，代表產(chǎn)品有Intervet公司生產(chǎn)的PRRomiS4○R滅活疫苗、Boehringer Ingelheim公司生產(chǎn)的Ingelvac PRRS KV○R滅活疫苗和 Merial公司生產(chǎn)的PROGRESSIS○R滅活疫苗。我國在PRRS疫苗的研究起步比較晚。哈爾濱獸醫(yī)研究所從2000年起用CH－1a株采用轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)技術(shù)，在Marc－145細胞上大量增殖了較高滴度（TCID50≥107.0）的PRRSV，經(jīng)甲醛滅活后制成油佐劑滅活疫苗［15］，用該疫苗免疫接種30頭3月齡豬，先后免疫接種2次，間隔20 d，在首免第5天就可檢到抗體，第28天抗體達到高峰，第56天抗體仍維持較高的水平。趙坤等［16］研制出了PRRS蜂膠佐劑組織滅活疫苗，臨床效果顯著。王隆柏等［17］以PRRSV Fuzhou 01株為制苗種毒，經(jīng)Marc－145細胞增殖、超速離心濃縮、甲醛滅活后，分別制成新型佐劑IMSl312滅活疫苗和油乳劑滅活疫苗，兩種疫苗病毒含量約為108.0TCID50／mL，結(jié)果表明這兩種滅活疫苗對斷奶仔豬有良好的免疫原性和安全性。王旭榮等［18］將PRRSV Nsp2基因缺失株Jiangxi－3的第9代病毒按常規(guī)方法制成油佐劑滅活疫苗，經(jīng)肌肉注射免疫PRRSV和豬圓環(huán)病毒 （PCV－2）抗原與抗體均為陰性的60日齡健康豬，結(jié)果表明，經(jīng)二次免疫后效果明顯。由于豬繁殖與呼吸綜合征與其他傳染病有混合感染的可能，所以也有二聯(lián)疫苗的相關(guān)報道。金擴世等［19］采用豬圓環(huán)病毒（PCV－2）和PRRSV強毒株研制成了PCV－2和PRRSV二聯(lián)滅活疫苗試驗結(jié)果表明，用該二聯(lián)疫苗免疫4周齡仔豬，免疫后7d即可檢測到抗PCV－2和PRRSV抗體，免疫后21d抗體可達較高水平，28dELISA抗體和中和抗體均達到高峰，這一結(jié)果與報道的PRRS油乳劑滅活疫苗抗體檢測結(jié)果相似。如今，我國PRRSV疫苗生產(chǎn)廠家是以NVDC－JXA1毒株為種毒生產(chǎn)滅活疫苗。由于PRRSV滅活疫苗的交叉保護性差，針對這一特點，有學(xué)者提出研制自家苗的說法，目前還沒有實施方面的報告。

3 弱毒疫苗

弱毒疫苗具有抗體產(chǎn)生快、持續(xù)時間長、保護力強，改善臨床癥狀的效果比滅活疫苗好等諸多優(yōu)點。目前，國內(nèi)外商品化PRRS弱毒疫苗所使用的病毒株主要來源于 ATCC－VR2332、I－1387／8、1－1140、CH－1a、JA－142、5710等PRRSV 強毒株。最早的商品化弱毒疫苗是由德國Boehringer Ingleheim公司的NOBL實驗室于1995年研制生產(chǎn)［20］。我國自主研制的PRRS活疫苗是以CH－1a株為原始種毒，通過體外細胞傳代致弱得到的，于2007年正式投放市場。2009年，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)與瑞普生物公司共同研發(fā)的PRRS活疫苗（R98株）也被批準為新獸藥。有文獻報道，將高致病性PRRSV HuN4毒株經(jīng)Marc－145細胞傳112代致弱后，可有效預(yù)防仔豬患高致病性PRRSV［21］。PRRSV弱毒疫苗最大缺點就是安全性差，Mortensen S等［22］研究表明，用PRRS弱毒苗接種母豬后，會對母豬的繁殖性能造成不利影響，甚至可通過子宮感染胎豬。Nielsen J等［23］用從胎兒、死胎及死亡仔豬中分離的疫苗源毒感染懷孕晚期母豬，證明疫苗源毒能在豬群中持續(xù)存在，并引發(fā)疾病。由于存在安全隱患，在歐洲（如德國）禁止用弱毒疫苗來預(yù)防PRRS，主要采取撲殺的方法凈化豬群。在國內(nèi)，安全性也是評價PRRS弱毒疫苗的重要指標之一。陳瑞愛等［24］使用高致病性PRRS（JXA1－R株）活疫苗對仔豬進行免疫，仔豬無不良臨床表現(xiàn)；使用該疫苗對配種前母豬、懷孕80d～90 d母豬、臨產(chǎn)前15d母豬進行免疫，母豬精神、食欲、體溫均正常，并在預(yù)產(chǎn)期順利產(chǎn)仔，而且JXA1－R株活疫苗表現(xiàn)出良好的安全性?，F(xiàn)在我國很多豬場在使用弱毒疫苗免疫豬群，實踐證明不僅能有效地控制了PRRS的發(fā)生與傳播，減少了經(jīng)濟損失，而且未見發(fā)生疫苗病毒毒力返強和基因重組。

4 培養(yǎng)PRRSV用細胞的相關(guān)研究

無論是病毒分離、疫苗生產(chǎn)，還是病毒致弱都需要有合適的細胞系。然而，PRRSV對細胞有嚴格的趨向性，這種趨向性是由細胞表面特異性受體或其它參與病毒侵入的蛋白質(zhì)決定的，包括硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素（Sn）以及CD163。PRRSV敏感的細胞系的研究較多，最初，研究人員只發(fā)現(xiàn)PRRSV能在豬原代肺泡巨噬細胞（PAM）中增殖復(fù)制，具較高產(chǎn)量，但成本高。沒有敏感的細胞系也給當時PRRSV研究帶來了一些障礙，后來一些研究表明PRRSV能在恒河猴胎腎細胞 MA－104中復(fù)制。1992年，Collins J E 等［25］利用由 Boehringer Ingelheim Animal Health公司建立的CL2621細胞系分離得到ATCC VR－2332毒株，由于該公司已申請專利，該細胞系的可用性較低。1993年，Kim H S等［26］利用限制稀釋法從 MA－104克隆得到 Marc－145細胞，并證明該細胞能用于PRRSV的增殖，目前Marc－145細胞應(yīng)用較廣泛。有學(xué)者對 Marc－145細胞病變機制進行了研究，劉伍梅等［27］通過形態(tài)學(xué)觀察證明PRRSV感染的 Marc－145細胞確實發(fā)生了細胞凋亡現(xiàn)象。此外，用來培養(yǎng)PRRSV的細胞系還有從Marc145中克隆出來的更為敏感HS.2H細胞系和CRL1171細胞系。2011年，Saqonq M等［28］通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）cDNA轉(zhuǎn)染至豬肺泡巨噬細胞（PAM）中獲得對PRRSV敏感的豬腫瘤細胞系。除尋找對PRRSV更為敏感的細胞系以外，將現(xiàn)有敏感細胞實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)也是各生物制品公司關(guān)注的焦點。工業(yè)化大生產(chǎn)所用的動物細胞培養(yǎng)主要包括以下幾種技術(shù)，滾瓶細胞培養(yǎng)技術(shù)、懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)和中空纖維細胞培養(yǎng)技術(shù)。雖然細胞培養(yǎng)方法有很多種，但是生物制品大規(guī)模生產(chǎn)時，懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)（包括微載體培養(yǎng)）是最佳培養(yǎng)方法。目前，我國病毒性疫苗的生產(chǎn)多采用大方瓶和轉(zhuǎn)瓶技術(shù)培養(yǎng)細胞和病毒，勞動強度高，占地面積大，生產(chǎn)不穩(wěn)定，難于進行質(zhì)量控制。但已有不少關(guān)于細胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)PRRS疫苗的報道，主要集中于微載體培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中各個關(guān)鍵工程參數(shù)尤其重要。宮飛等［29］對微載體培養(yǎng)Marc－145細胞的條件進行了優(yōu)化，以微載體細胞密度4×104個／mg、微載體濃度7mg／mL，在高糖 DMEM （含30mmol／L葡萄糖，6mmol／L Gln）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，48h后每12h換液50% 的培養(yǎng)方式效果最為理想。穆光慧等［30］利用Cytodex－3微載體培養(yǎng) Marc－145細胞并測定PRRSV在微載體培養(yǎng)的細胞上的TCID50，表明細胞接種密度為4.28×105cells／mL 時，病 毒 滴 度 可 達 到 107.5TCID50，證明利用微載體增殖PRRSV是可行的。

5 結(jié)語

由于PRRSV具有高度變異的特點，為疫苗研究和疾病防范帶來了挑戰(zhàn)。在絕大多數(shù)省份存在疫情、規(guī)模飼養(yǎng)和散養(yǎng)長期并存和牲畜流通頻繁及生物安全現(xiàn)狀不容樂觀的背景下，就我國PRRS流行現(xiàn)狀而言，應(yīng)用疫苗預(yù)防PRRS應(yīng)該是最佳選擇?，F(xiàn)有的滅活疫苗交叉保護性差，但使用安全，常用于PRRS陰性群或種豬場。弱毒疫苗具有抗體產(chǎn)生快、持續(xù)時間長、保護力強，但源毒能在豬群中持續(xù)存在，存在安全隱患。2010年，我國PRRS弱毒疫苗進入國家強制免疫計劃，疫苗需求量顯著增加，因此，實現(xiàn)生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)是一種必然趨勢。由于持續(xù)感染、隱性帶毒普遍，加上存在抗體依賴性增強作用，導(dǎo)致常規(guī)疫苗免疫保護效果較差，研發(fā)確實、可靠、高效的新一代疫苗也是未來一個方向。

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