趙 德，喬 翠，張 強(qiáng)，郭建宏，高鳳山，＊

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116622；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，甘肅蘭州 730046）

人類歷史上，疫苗的發(fā)展史可以分為3個(gè)階段：古典疫苗時(shí)期，即在病原體發(fā)現(xiàn)前據(jù)反復(fù)觀察和摸索經(jīng)驗(yàn)而研制出疫苗的時(shí)期，例如英國鄉(xiāng)村醫(yī)生Jenner用牛痘接種到人體上，使人獲得免疫能力；傳統(tǒng)疫苗時(shí)期，即利用病變組織、人工培養(yǎng)的病原微生物制備滅活疫苗和減毒疫苗的時(shí)期；基因工程疫苗時(shí)期，即采用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)疫苗的時(shí)期。傳統(tǒng)疫苗可分為減毒活疫苗和滅活疫苗。傳統(tǒng)疫苗最大的優(yōu)點(diǎn)就是免疫力強(qiáng)、保護(hù)性好，減毒活疫苗缺點(diǎn)是存在毒力恢復(fù)、散毒或基因重組等潛在的生物危害。

當(dāng)病原微生物入侵機(jī)體，給機(jī)體造成傷害的同時(shí)，也會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)。疫苗免疫的基本原理就是利用既能激起免疫應(yīng)答反應(yīng)，又不會(huì)造成傷害的生物制劑，使機(jī)體獲得相應(yīng)的免疫能力，免疫應(yīng)答反應(yīng)并非針對整個(gè)外源物質(zhì)，而僅僅是針對表位，通常是一段多肽。表位疫苗是近年來發(fā)展起來的一種新型疫苗，它是利用基因工程手段，體外表達(dá)或人工合成病原微生物的抗原表位，將其作為一種疫苗使用［1］。表位又稱抗原決定簇，是抗原分子中決定抗原特異性的化學(xué)基團(tuán)，它是能夠與T細(xì)胞抗原受體TCR或B細(xì)胞抗原受體BCR特異性結(jié)合的基本單位，最終激起機(jī)體的免疫反應(yīng)，形成對病原微生物的免疫能力。因此，表位疫苗符合未來疫苗發(fā)展的方向。

1 表位篩選

要研制表位疫苗，首先要篩選出需要的表位。表位是一個(gè)免疫學(xué)概念，因此表位的鑒定可以利用與其相關(guān)的免疫反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，T細(xì)胞表位利用細(xì)胞免疫應(yīng)答鑒定，B細(xì)胞表位利用表位與抗體的特異反應(yīng)鑒定［2］。

1.1 蛋白質(zhì)降解法

蛋白質(zhì)降解法是用一些化學(xué)物質(zhì)或者酶將蛋白質(zhì)降解成多個(gè)多肽片段，然后從降解得到的肽混合物中分離得到目的肽。利用化學(xué)降解法已成功從多種蛋白，例如谷蛋白、細(xì)胞色素b、珠蛋白、血清蛋白中分離得到抗原表位多肽。酶法主要是用酶水解抗原抗體復(fù)合物，其原理是抗原抗體復(fù)合物的結(jié)合部位能抵抗蛋白酶的水解作用［3］?；瘜W(xué)法與水解法確定抗原表位的特異性高，但操作復(fù)雜繁瑣，只能獲得線性表位。

1.2 肽探針掃描技術(shù)

根據(jù)已知病毒的蛋白基因序列，合成連續(xù)重復(fù)的重疊多肽，通過與抗體的結(jié)合，篩選出陽性片段。這一技術(shù)要求明確抗原分子的一級結(jié)構(gòu)，只能檢測抗原線性表位?？谔阋卟《荆‵oot－and－mouth disease virus，F(xiàn)MDV）細(xì)胞表位的確定大多使用此法 。Jerner W等［4］對覆蓋FMDV蛋白全長的442段十五肽進(jìn)行了淋巴細(xì)胞功能檢測，最終確定了位于VP1上第66～80位氨基酸的一個(gè)牛主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）特異的T細(xì)胞表位。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是鑒定的T細(xì)胞表位較可靠，且能發(fā)現(xiàn)一些不符合肽結(jié)合基序（motif）的MHC分子結(jié)合抗原肽。但這種方法也有其局限性，不但工作量大、費(fèi)用高，而且重疊之間的表位有可能被忽略，所以不能夠鑒定出目的蛋白上所有T細(xì)胞表位。

1.3 隨機(jī)肽庫技術(shù)

將編碼表位多肽的寡聚核苷酸整合到編碼噬菌體表面蛋白的基因上，該基因表達(dá)后的蛋白中含有目的多肽，展示在噬菌體表面。通過設(shè)計(jì)出編碼不同多肽的寡聚核苷酸可以在噬菌體表面展示多達(dá)109以上不同的多肽序列，幾乎可以涵蓋所有的抗原表位。利用抗原表位可以與抗體進(jìn)行特異性結(jié)合的特性，篩選出目的抗原表位，然后將抗體固定在酶標(biāo)板上，與肽庫噬菌體結(jié)合，洗去未結(jié)合的噬菌體，經(jīng)過幾輪篩選，就可以得到能夠與抗體特異性結(jié)合的噬菌體。通過DNA序列分析，得出該噬菌體攜帶的外源序列，進(jìn)而得出目的表位的氨基酸序列。

Gazarian K等［5］最近利用噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建了展示7肽至12肽的豬偽狂犬病病毒的噬菌體展示庫，最后篩選出一個(gè)由10個(gè)氨基酸組成的共有基序，免疫C57BL／6小鼠后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了偽狂犬病病毒的血清中和抗體，攻毒試驗(yàn)表明除了2只小鼠外，其余小鼠都能夠存活。

1.4 計(jì)算機(jī)表位預(yù)測

計(jì)算機(jī)表位預(yù)測是指通過計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測B細(xì)胞表位或者T細(xì)胞表位。在已知抗體蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，可以做到既能預(yù)測構(gòu)象表位，又能預(yù)測線性表位，并能夠用圖直觀的表示出來。在已知氨基酸序列的基礎(chǔ)上，可以利用氨基酸的理化數(shù)據(jù)特征，預(yù)測可能含有表位的區(qū)域。此外，也可以在噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上預(yù)測表位。Saha S等［6］采用了一種分類算法，該系統(tǒng)檢驗(yàn)了源于Bcipep數(shù)據(jù)庫的700個(gè)非冗余B細(xì)胞表位和源于Swiss－Prot數(shù)據(jù)庫的700個(gè)長度為10個(gè)～20個(gè)氨基酸的隨機(jī)選擇多肽，準(zhǔn)確率接近66%。另外，由于T細(xì)胞免疫的過程首先需要MHC分子與抗原表位緊密結(jié)合，形成復(fù)合體。目前已有多種軟件可以根據(jù)復(fù)合物的三維構(gòu)象、結(jié)合多肽的氨基酸序列等信息預(yù)測表位［7］。

2 表位疫苗的載體

由于表位多肽只是一段氨基酸殘基，免疫原性較差，且容易被降解，因此在實(shí)際使用過程中需要借助一定的載體才能發(fā)揮免疫作用。

2.1 脂質(zhì)載體

脂質(zhì)分子本身不具備免疫原性，但可以作為載體連接在抗原肽的末端，幫助肽分子被抗原呈遞細(xì)胞識別，不僅使表位多肽在機(jī)體內(nèi)能夠穩(wěn)定存在而不被降解，而且可以增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，脂質(zhì)分子是一種較為理想的表位疫苗載體。

Theradigm－HBV制劑是一種治療乙肝的表位疫苗，該表位疫苗含有乙肝病毒18～27肽段的CTL（cytotoxic T leukocyte）表位，該表位肽段與脂質(zhì)分子棕櫚酸連接從而組成一種脂質(zhì)表位疫苗，該疫苗已經(jīng)在小鼠和人體內(nèi)試驗(yàn)成功［8］。另外，抗流感病毒和抗艾滋病病毒的脂肽疫苗的研究也取得了一定的成果。

免疫刺激復(fù)合物（immunostimulating complex，ISCOM）是20世紀(jì)80年代發(fā)明的一種脂質(zhì)體，其主要成分為一種皂角素（Quil A），它可以包裹病原微生物的抗原蛋白或者多肽，在體內(nèi)緩慢釋放并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。目前ISCOMs應(yīng)用較為廣泛，吳隼等［9］利用中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)的重組型乙肝病毒表面抗原制備成免疫刺激復(fù)合物型疫苗，為ISCOMs型乙肝疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)［9］。Pahar B等［10］最近將猿猴感染的HIV的輔助性T細(xì)胞表位和CTL表位與ISCOM相連形成免疫原，接種恒河猴后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定水平的抗HIV免疫保護(hù)性反應(yīng)。

2.2 蛋白載體

乙型肝炎病毒（乙肝病毒）的核心蛋白能夠允許一定程度的缺失和插入，并且能夠?qū)⑼庠葱蛄懈呙芏鹊乇┞对诘鞍最w粒表面。2008年，Gregson等報(bào)道了將乙肝病毒核心蛋白的78位和79位氨基酸之間插入惡性瘧原蟲免疫顯性B細(xì)胞表位［（NANP）3］和一個(gè) HLA（human leukocyte antigen）限制性CD4表位 （NANPNVDPNANP），并在 HBc的149位氨基酸后融合一個(gè)通用的T細(xì)胞表位（326aa～345aa），制成重組的表位疫苗，在歐洲一些國家臨床試驗(yàn)證明該疫苗在所有劑量水平上都是安全的，而且有很好的耐受性。英國Acambis公司研制的針對流感病毒所有A型株的表位疫苗ACAM－FLU－A（TM），以乙肝病毒的核心蛋白氨基端163個(gè)氨基酸作為載體來遞送流感病毒離子通道蛋白M2的胞外結(jié)構(gòu)域M2e，臨床試驗(yàn)證明該疫苗具有很好的耐受性和免疫原性［11］。

熱休克蛋白（HSP）也可作為表位疫苗的蛋白載體，在腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用，通過分子載體的作用將抗原肽呈遞APC表面，激活CD8＋T細(xì)胞，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。HSP根據(jù)分子量的不同分為4類，即HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和最小的HSP家族?，F(xiàn)在認(rèn)為，HSP90家族和HSP70家族與外來抗原的攝入及參與MHC－Ⅰ類分子的結(jié)合有關(guān)。HSP70家族的成員還參與新生肽的折疊，并協(xié)助表位肽與TAP（transporter associated with antigen processing）的結(jié)合。Ren F等［12］將 HSP與人乳頭瘤病毒 HPB－16E7的CTL表位多肽偶聯(lián)，并以腺病毒作為多肽DNA的載體，形成的DNA疫苗能夠很好地清除動(dòng)物模型中的腫瘤細(xì)胞，并可誘導(dǎo)CTL細(xì)胞的活化。另外，卵清蛋白（OVA）、牛血清蛋白 （BSA）、鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）等也可作為表位疫苗的蛋白載體。肖志軍等［13］將傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白線性B細(xì)胞抗原表位肽PJ14和PJ15與OVA偶聯(lián)免疫小鼠，結(jié)果顯示，免疫小鼠產(chǎn)生了PJ14和PJ15抗體，持續(xù)期達(dá)21周。宋幸輝等［14］將傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白線性B細(xì)胞抗原表位肽P22與牛血清蛋白（BSA）偶聯(lián)，并得到了相應(yīng)的抗原，臨床試驗(yàn)證明具有一定的免疫保護(hù)作用。朱彥彩等［15］采用DEC一步法將His6多肽與KLH偶聯(lián)，制備人工結(jié)合抗原免疫小鼠，成功制備了His6免疫原。

2.3 佐劑

為了加強(qiáng)多肽疫苗的免疫效果，有時(shí)候使用佐劑作為一種載體與多肽疫苗一起進(jìn)行免疫。目前最常用的是弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。弗氏佐劑是一種經(jīng)典的免疫佐劑，分為完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑。Siegel C T等［15］將ras突變體多肽加完全弗氏佐劑免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)10d內(nèi)小鼠T細(xì)胞活化，14d內(nèi)出現(xiàn)針對該多肽的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。石統(tǒng)東等［16］合成了基于免疫優(yōu)勢性 HbcAg CTL表位、PreS2B細(xì)胞表位和破傷風(fēng)類毒素通用Th表位的多肽，經(jīng)弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，經(jīng)檢測小鼠產(chǎn)生了特異性抗體。

氫氧化鋁可以吸附表位多肽，也可作為一種載體用在表位疫苗的研制上。Hariharan K等［17］用氫氧化鋁或鋁鹽作為HPV－16E7多肽疫苗的佐劑免疫C3H小鼠，用HOPE2腫瘤細(xì)胞攻擊小鼠，發(fā)現(xiàn)用氫氧化鋁化鋁鹽佐劑較PROVAXTM佐劑更能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長。而Ghochikyan等的研究發(fā)現(xiàn)，將老年癡呆癥病毒的輔助性T細(xì)胞表位2（Th2）的佐劑由氫氧化鋁換為Quil A后，免疫后產(chǎn)生的抗體要高于只使用氫氧化鋁佐劑乳化表位疫苗?？梢姡壳皩τ跉溲趸X佐劑在表位疫苗方面的的應(yīng)用效果還不是十分明了。

3 表位疫苗的優(yōu)化

在實(shí)際的應(yīng)用中，為增強(qiáng)表位疫苗的免疫活性，還需要采用各種方式對表位疫苗進(jìn)行優(yōu)化。

3.1 抗原表位線性串聯(lián)

抗原表位線性串聯(lián)是指采用人工合成的方法將多個(gè)不同的抗原表位串聯(lián)起來，構(gòu)建具有多種表位肽的復(fù)合多價(jià)表位疫苗，該方法可以有效增強(qiáng)抗原表位多肽的免疫原性，同時(shí)也能夠避免載體的引入可能造成的不確定影響。吳紹強(qiáng)等［18］利用分子生物學(xué)軟件分析了FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP3上可能的抗原表位，并人工合成了8條表位多肽。通過采用SATⅡ型FMDV陽性血清進(jìn)行ELISA反應(yīng)，檢測其反應(yīng)原性，然后通過采用與載體蛋白偶聯(lián)的合成肽免疫接種小鼠，測定小鼠血清中抗體效價(jià)，檢測合成肽的免疫原性。結(jié)果表明，合成的8條多肽均能與SATⅡ型FMDV陽性血清結(jié)合，其中的6條多肽免疫小鼠后能產(chǎn)生針對多肽的抗體。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)表位串聯(lián)時(shí)一般要串聯(lián)30個(gè)以上的氨基酸才具有較好的免疫原性［19］。

3.2 MAP空間模式

多價(jià)抗原肽（multiple antigen peptide，MAP）是將病原微生物蛋白表面的多種B細(xì)胞或T細(xì)胞表位的氨基酸連接于樹枝狀的多聚賴氨酸結(jié)構(gòu)上，構(gòu)建一種立體結(jié)構(gòu)的多價(jià)表位疫苗，這種方式鏈接的表位多肽可以具有較好的方向性，但是賴氨酸骨架的化學(xué)合成成本較高。Joshi M B等［20］將瘧疾的多個(gè)T細(xì)胞以及B表位多肽連接到寡聚氨基酸叢狀結(jié)構(gòu)上，構(gòu)建MAP抗原，免疫小鼠，結(jié)果顯示其具有一定的免疫活性。

3.3 表位修飾

在表位串聯(lián)時(shí)可能會(huì)在連接處產(chǎn)生新的表位，從而影響原表位的免疫活性。婁加陶把結(jié)核桿菌抗原 Rv0309、Rv0173的 HLA－A－＊0201限制性CD8＋CTL表位與其他已知抗原表位優(yōu)化組合，并引入PADRE及“木馬肽”序列，采用furin肽酶識別基序RVKR作為接頭，構(gòu)建并重組表達(dá)、純化“串珠式”表位肽疫苗，并在細(xì)胞水平上對其免疫原性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，重組表達(dá)的“串珠式”表位肽在細(xì)胞水平上能誘導(dǎo)出更強(qiáng)的CTL保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)［21］。石統(tǒng)東等研究發(fā)現(xiàn)，設(shè)計(jì)HBV治療性表位多肽疫苗時(shí)，在CTL表位的基礎(chǔ)上引入“Th＋B”細(xì)胞表位以及3個(gè)丙氨酸的間隔序列，可以爭強(qiáng)CTL表位肽的免疫原性［22］。雖然MHC分子與表位的結(jié)合是特異性的，但這種特異性不是指只能與單一的肽段結(jié)合，而是指可以識別一系列具有某些共同特性的肽段，其中包括一些經(jīng)過修飾的非天然肽段，即修飾的肽配體（altered peptide ligand，APL）。通過對肽分子進(jìn)行修飾，在特定的位置替換成與 MHC有較高親和力的氨基酸，有利于表位肽與MHC分子的結(jié)合。唐艷將黑色素瘤相關(guān)抗原 MART1／MelanA（27～35）（AAGIGILTV）表位的P1位由L替換為A，提高了表位的免疫原性［23］。

4 表位疫苗的使用現(xiàn)狀

與傳統(tǒng)疫苗相比，表位疫苗有著明顯的優(yōu)勢，目前，表位疫苗在腫瘤以及病毒性疾病的預(yù)防方面已經(jīng)有了較廣泛的應(yīng)用，同時(shí)在細(xì)菌、寄生蟲等引起的疾病的防治中也取得了一定的進(jìn)展。

4.1 腫瘤多肽疫苗

腫瘤多肽表位疫苗是來自腫瘤特異性抗原、病毒相關(guān)抗原、癌基因或癌基因突變蛋白的多肽組成的疫苗。Powell D J等［24］用相關(guān)多肽皮下注射5位黑色素瘤患者，經(jīng)過1年的治療，患者循環(huán)系統(tǒng)中相應(yīng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞從4.8%上升至35.1%，并出現(xiàn)了記憶T細(xì)胞。Letsch A等［25］運(yùn)用表位疫苗治療9名至少經(jīng)過3次黑色素瘤切除后又復(fù)發(fā)的患者，并進(jìn)行長期隨訪，觀察發(fā)現(xiàn)治療效果明顯，該研究小組因此認(rèn)為應(yīng)用多肽疫苗可延長惡性黑色素瘤復(fù)發(fā)時(shí)間間隔。

4.2 病毒表位疫苗

20世紀(jì)80年代，Strohmaier K等［26］發(fā)現(xiàn)FMDV含有能引起細(xì)胞免疫應(yīng)答的特殊氨基酸位點(diǎn)，即病毒表位，從而開始了病毒表位疫苗的研究。目前，HIV以及丙型肝炎病毒等相關(guān)的表位疫苗也進(jìn)入臨床試驗(yàn)。Kran A M 等［27］使用 Vacc－4x肽疫苗，免疫40位HIV陽性患者，無任何不良反應(yīng)。同時(shí)，體外誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖試驗(yàn)，結(jié)果產(chǎn)生明顯的免疫應(yīng)答反應(yīng)。Chua B Y等［28］通過CD4＋T細(xì)胞輔助表位合成一種脂肽，能誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的CD8＋T細(xì)胞應(yīng)答，清除患者體內(nèi)的HCV病毒。

4.3 細(xì)菌表位疫苗

表位疫苗在抗菌方面的應(yīng)用也較為廣泛。Chen J G等［29］構(gòu)建了銅綠假單胞菌多表位MyD88基因疫苗，成功地刺激小鼠產(chǎn)生高度特異性的抗體，氣管接種該疫苗的小鼠肺勻漿細(xì)菌計(jì)數(shù)明顯低于對照組。另外，周維英等［30］構(gòu)建了幽門螺旋桿菌黏附素和尿素酶B亞單位雙亞基多表位疫苗，免疫檢測有較好的免疫原性。

4.4 寄生蟲表位疫苗

抗寄生蟲的表位疫苗相對較少，目前僅有少數(shù)寄生蟲表位疫苗的使用。賈逵等將弓形蟲新基因wx2中的2個(gè)編碼表位的片段w2a和w2b構(gòu)建到重組質(zhì)粒中，制成表位基因疫苗免疫小鼠，獲得了較好的效果［31］。另外，對抗日本血吸蟲病表位疫苗的研究也取得了一定進(jìn)展。

5 問題和展望

目前，表位疫苗的應(yīng)用仍面臨許多亟待解決的問題。例如，表位的作用機(jī)制尚不完全清楚；表位多肽分子較小，免疫原性較弱，而佐劑的使用一定程度上會(huì)增加表位疫苗的副作用；多肽合成以及純化技術(shù)的局限性也增加了表位疫苗的使用風(fēng)險(xiǎn)。另外，筆者認(rèn)為表位研究的不均衡也是目前表位疫苗研究中存在的一個(gè)主要問題，尤其對于動(dòng)物病毒。譬如，對于FMDV，此前的表位研究主要集中于B細(xì)胞表位和Th細(xì)胞表位，而缺乏對CTL細(xì)胞表位的研究，導(dǎo)致表位疫苗中表位的組成缺乏必要的CTL表位。目前，筆者所在課題組正在篩選FMDV的CTL表位，為今后開發(fā)和研制FMDV的CTL表位奠定基礎(chǔ)。

總之，在今后的表位疫苗研制過程中，還有許多方面亟待完善，因此需要從事表位研究的科研工作者堅(jiān)持不懈的努力。

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