孟 霞，魯秦安，唐彩琰，陳樹林＊，張文華

（西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.西安文理學院，陜西西安 710065）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在進化過程中，由高度保守的雙鏈RNA（double－stranded RNA，dsRNA）誘導同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象［1］。它是生物體抵御外來感染的一種重要保護機制，為此RNAi被《Science》雜志評為2001年十大科技突破之一，名列2002年十大科學之首。2002年Nature雜志亦將RNAi評為年度重大科技成果之一?，F(xiàn)已證明RNAi現(xiàn)象廣泛存在于大多數真核生物中。dsRNA作為細胞內源性基因表達調節(jié)物，具有低毒性和高特異性等特點，且具有很強的基因沉默效率。dsRNA與靶基因有序列同源性，長雙鏈RNA被導入或轉染至細胞內時，會被Dicer酶（dsRNA specific endonuclease，Dicer）裂解成短小干擾 RNA（short－interfering RNA，siRNA），然后被結合到誘導沉默復合體RISC（RNA－induced silencing complex，RISC）上，引導 Ago2蛋白（slicing protein Argonatue 2）裂解靶基因 mRNA［2］。RNA干擾以其序列特異性的優(yōu)勢被廣泛應用于阻斷或抑制基因表達，這也使得它成為基因功能和基因治療的研究工具。在RNAi發(fā)揮基因沉默效能的過程中，許多因素都會直接或間接的影響最終的沉默效率和沉默時間。這些因素可被分別定位于3個不同的層次，包括siRNA類型的選擇，siRNA的遞送過程及細胞內的RNAi路徑。本文分別就這3個層次和RNAi基因沉默動力學的數學模型及其應用做一綜述，以期能幫助人們更深入地認識RNAi，促進RNAi在臨床上的應用進程。

1 干擾RNA類型的選擇

dsRNA是RNAi的初始誘導因子，但是，dsRNA必須被進一步加工成適當大小的siRNA才能發(fā)揮作用。RNAi的效應分子主要有兩類，即siRNA和短發(fā)夾 RNA（short hairpin RNA，shRNA）。在被應用于引發(fā)基因沉默效應的過程中，化學合成的siRNA和載體表達的shRNA各存在其優(yōu)缺點，現(xiàn)從4個方面予以論述。

1.1 siRNA和shRNA在產生非特異性反應方面的優(yōu)缺點

siRNA在細胞內的穩(wěn)定性較差，易被細胞內核酸酶降解，因此較易產生脫靶效應；shRNA在細胞核內產生，易于被細胞內的特異機制進行適當的剪接，因此引起免疫副反應的幾率較小。細胞內過多的shRNA會與內源性的微小RNA（microRNA，miRNA）競爭核轉運受體，干擾miRNA正常功能的發(fā)揮，產生細胞毒性作用，而siRNA不會干擾miRNA的功能，不會產生類似的毒性。與shRNA相比，siRNA易于被進行適當的修飾，在不影響其沉默效率的同時提高其穩(wěn)定性，減輕非特異性反應的發(fā)生。

1.2 siRNA和shRNA在沉默效應的持續(xù)時間方面的優(yōu)缺點

在分裂活躍的細胞中，固定數量的siRNA隨細胞的分裂不斷被稀釋，導致其沉默效應的短暫性。載體表達的shRNA可被整合于宿主細胞染色體，由宿主細胞持續(xù)合成，使其沉默效應能維持較長時間。Rao D D等［3］研究表明，少于5個拷貝的shRNA整合入宿主染色體就能有效地引起長時間的基因沉默效應。Takahashi Y等［4］研究表明，載體表達的shRNA誘導的基因沉默效應的持續(xù)時間顯著長于siRNA的沉默效應時間。

1.3 siRNA和shRNA在轉染效率方面的優(yōu)缺點

siRNA在細胞質中直接與RISC結合降解靶mRNA，因此，一旦siRNA進入細胞質便能立即發(fā)揮其基因沉默效應。相反，shRNA的表達載體需要首先被轉染進細胞核，轉錄出shRNA，然后再將shRNA運出細胞核，在細胞質中被剪切成siRNA發(fā)揮作用?；蛑委熝芯勘砻?，跨細胞核運輸是轉染過程中遇到的最大挑戰(zhàn)之一。因此，在轉染效率方面，siRNA較shRNA具有更大的優(yōu)勢。

1.4 siRNA和shRNA在臨床應用方面的優(yōu)缺點

化學合成的siRNA引起短暫的基因沉默效應，因此可根據治療需要隨時調整用量。shRNA表達載體通過插入基因組持續(xù)表達shRNA發(fā)揮作用，基因沉默效率相對較高。同時，插入shRNA表達載體的基因可因組蛋白的修飾和啟動子區(qū)CpG島的高度甲基化而被沉默，但這種染色質的沉默不僅不能引起長時間的轉基因表達，還會導致轉基因活性逐漸消失。而且，細胞核內shRNA連續(xù)的高濃度表達還會引起細胞毒性作用。

綜上考慮，siRNA和shRNA在發(fā)揮RNAi效應的不同方面各存在優(yōu)缺點，實際應用中應根據具體情況選擇合適的小干擾RNA。

2 siRNA的遞送

siRNA在細胞內發(fā)揮基因沉默，因此，化學合成的siRNA要想發(fā)揮沉默效應，必須經歷從體外到細胞內的轉染過程，在其到達正確的靶細胞位置之前，有許多細胞外因素會影響它的穩(wěn)定性和傳遞效率，要想最終發(fā)揮良好的沉默效應，必須克服這些障礙。siRNA的系統(tǒng)性遞送必須涉及提高其循環(huán)半衰期和組織靶向性的機制［5］。

2.1 機體中核糖核酸酶對siRNA的降解

眾所周知，siRNA極不穩(wěn)定，一旦進入機體，會很快被細胞外環(huán)境中的核糖核酸酶（RNase）降解，導致其在血液中的半衰期不足30min。通過對siRNA進行化學修飾的方法可以增強其對血液中RNase的穩(wěn)定性［6］，保護其免受降解?；瘜W修飾主要包括糖配基修飾、磷酸鹽連接修飾、堿基修飾、末端懸掛堿基修飾和末端結構修飾以及雙鏈結構修飾等［7］。這些修飾不會減弱siRNA的作用，相反，在提高其穩(wěn)定性的同時，還可顯著提高其沉默效率。

2.2 腎對siRNA的清除

除了RNase導致的降解外，由于siRNA高度親水且其分子量很小，遠遠低于腎小球過濾的最小界限，它們可很快被腎小球濾過清除，因此，腎的清除是影響體內siRNA半衰期的重要限制因素。有些化學修飾（如RNA骨架中的硫代磷酸酯連接和4＇含硫核苷酸）可通過促進siRNA與血清蛋白的結合而提高它的半衰期。一種更方便快捷地調控和促進siRNA生物分布的方法就是通過連接于小分子量配基來改變siRNA的結構，幾個比較令人關注的例子就是siRNA與抗體重鏈Fab片段，與膽固醇、膽汁酸和長鏈脂肪酸等油脂分子，與細胞滲透性多肽（cell－penetrating peptides，CPP）等 的 結 合［8－9］。 抗體可精確識別細胞內外抗原，實現(xiàn)siRNA的正確定位。siRNA有選擇地結合進富含磷脂質和膽固醇（主要是高密度脂蛋白和低密度脂蛋白）的脂蛋白顆粒內。這些親脂性的siRNA－脂蛋白復合體通過回避腎的清除和經由脂蛋白的受體促進細胞的攝取而達到提高siRNA生物分布的作用。CPP又稱為蛋白轉導結構域或膜轉導序列，它是短的陽離子多肽，最多含有30個氨基酸，它可以通過直接穿越細胞膜或通過細胞的內吞作用被攝取而達到傳遞siRNA到細胞內的作用。

2.3 siRNA的靶向性

siRNA準確高效的干擾作用的發(fā)揮要求siRNA必須具有靶向性。研究證明，體細胞對siRNA會產生強烈的炎癥反應，非靶向的細胞會攝取大量siRNA，在大量消耗siRNA的同時，還增強了炎癥反應的程度。由此可見，siRNA的遞送方式也直接影響RNAi效應的發(fā)揮。要解決這一問題，就要找到適合特定組織的siRNA遞送方式。目前，已有很多成功的例子。

核苷酸還原酶M2亞基（RRM2）是一個抗癌靶點，Davis M E 等［10］使用納米顆粒包裹 RRM2 siRNA，并且在顆粒表面有轉鐵蛋白（TF）使其具有靶向性，將納米顆粒分別在第1、3、8、10、21天通過靜脈注射注入三位黑色素瘤患者體內，并且不同患者給予不同的劑量。在經過一個治療周期后，腫瘤組織活檢結果發(fā)現(xiàn)，納米顆粒可以特異定位于腫瘤組織當中，而在其相鄰的表皮中沒有發(fā)現(xiàn)。腫瘤組織當中的納米顆粒的密度隨著給藥劑量的增大而增強。此外，通過實時定量逆轉錄－PCR（qRT－PCR）來測定患者腫瘤組織當中的RRM2mRNA水平，經過納米顆粒治療后，該mRNA水平有顯著降低，并且這一過程具有劑量依賴的關系。通過免疫組織化學染色及Western bot的方法證明在siRNA治療后，RRM2蛋白質表達水平同樣降低。這些結果提示，全身給予攜帶siRNA的靶向納米顆粒后，該顆?？梢蕴禺愋缘囟ㄎ挥谀[瘤組織，并且有效地通過siRNA抑制靶基因的轉錄和翻譯從而達到治療效果。

脂質納米顆粒（liposomal nanoparticles，LNPs）能有效地遞送siRNA，尤其是其中的一類稱為穩(wěn)定核酸脂質復合物（stable nucleic acid lipid particle，SNALP），通過對脂類進行PEG修飾使得復合物獲得了親水性外層，從而增強了其在血漿中的穩(wěn)定性。SNALP還增加siRNA的載荷并且改善細胞對siRNA的攝取及胞內釋放，因此SNALP被應用于人臨床治療中多種肝靶向性的RNAi項目。最近2年，研究發(fā)現(xiàn)了2種新型的可電離的和陽離子的脂質［11－12］，它們具有良好的活性，可被應用于新一代的LNP－siRNA遞送系統(tǒng)。它們都介導有效的LNP對siRNA的遞送，分別被稱為可電離的LNPs（iLNPs）和陽離子LNPs（cLNPs）。Akinc A 等［13］證明載脂蛋白E（apoE）是iLNPs的內源性的靶向性配基，它介導iLNPs對siRNA的肝靶向性運輸。

3 細胞內的RNAi途徑

siRNA在克服RNase的降解和腎的清除作用順利進入細胞內后，也有很多因素會影響其沉默效率。

3.1 siRNA從內吞體的逃逸

被內吞作用攝取的siRNA通常會被困在內吞體中而無法擴散到細胞質中發(fā)揮作用，這種現(xiàn)象在主要通過內吞作用被攝取的siRNA載體中最常見。這種情況下，如何提高siRNA從內吞體的逃逸率成為關鍵問題。截至目前，已有多種方法被用于應對解決這一難題。在此以CPP的運輸為例進行說明。CPP和siRNA的復合體主要通過內吞作用進入細胞，進入后即被困于內吞體內。主要有兩種方法可以促進復合體的釋放。其一，可將能破壞細胞膜穩(wěn)定性的化學試劑或融合肽連接于siRNA／CPP復合體，通過破壞細胞膜促進siRNA的釋放［14］。其二，可將光敏劑或熒光染料連接于siRNA／CPP復合體，在光刺激下，光敏劑或熒光染料誘導產生高活性的單線態(tài)氧，促進內吞體細胞膜破裂釋放siRNA。而且，這種光誘導的siRNA釋放方法還提供了一種從時空上控制RNAi的思路。Endoh T等［15］將一種僅在特定波長下才被激活的熒光染料連接于CPP上，通過控制光強度調節(jié)RNAi的發(fā)生。在這種情況下，光刺激不是RNAi的增強因子，而是激發(fā)因子。這樣，就可人為地控制RNAi的發(fā)生時間，這對我們將RNAi應用于局部治療是非常有利的。

3.2 細胞內AGO蛋白的可用性

AGO蛋白是影響siRNA沉默效率的主要的細胞內因子。Lund E等［16］研究表明，內源性Ago2核酸內切酶活性缺失的早期胚胎和卵母細胞不能發(fā)生RNAi。眾所周知，AGO蛋白是RISC中具有mRNA剪切活性和翻譯抑制活性的蛋白質，siRNA先導鏈只有裝載于AGO蛋白上才能發(fā)揮基因沉默效應［17］。而AGO蛋白還可結合miRNA，也就意味著如果AGO蛋白大部分被miRNA占據，進入細胞內的siRNA就會找不到AGO蛋白來對其進行裝載，導致siRNA未發(fā)揮作用就被降解。就這一點而言，細胞內RNAi的效率在很大程度上取決于AGO蛋白的可用性［18］。因此，如果要用外源性的siRNA來誘導RNAi，為取得良好的沉默效果，可以通過提高細胞表達AGO蛋白的效率來為外源siRNA提供充足的“空載”AGO蛋白。已經有研究證明，AGO蛋白的超表達可以提高哺乳動物細胞內的RNAi效率［19］。但是，目前仍不知道機體內AGO蛋白的表達是如何被調控的，也不知道如何控制AGO蛋白的表達，所以這方面還需進一步的深入研究。

3.3 病毒編碼的RNAi沉默抑制因子

RNAi是機體內部固有的抗病毒機制，為了克服這種抗病毒反應，病毒也相應的編碼一些RNAi沉默抑制因子（RNA silencing suppressor，RSS），這些RSS通過多種途徑降低RNAi的沉默效應［20］。RSS主要以兩種形式發(fā)揮作用：蛋白質形式和RNA形式。抑制蛋白可以通過抑制Dicer活性或者與dsRNA結合來降低RNAi的效率。病毒相關的RNA可以通過與Dicer和RISC結合使其達到飽和狀態(tài)不能結合siRNA而阻止RNAi反應，它們還可以作為miRNA發(fā)揮作用抑制宿主mRNA的翻譯，同時，它們還通過抑制Exportin 5的作用限制premiRNA從細胞核到細胞質的運輸。為了提高RNAi效率，我們可以設計針對RSS的siRNA，通過限制RSS在細胞內的表達減輕它的抑制效應，從而使RNAi更好地發(fā)揮抗病毒作用。

3.4 預想的沉默目標

細胞內靶mRNA的數量和靶蛋白的穩(wěn)定性也會影響siRNA的干擾效率［21］。細胞內siRNA的存活需要有效數量的靶mRNA的存在，因此靶mRNA的轉錄水平會直接影響siRNA在細胞內的持續(xù)時間。如果靶蛋白的半衰期很長，即使siRNA能夠有效地抑制靶mRNA的翻譯，由于殘余數量的靶蛋白的存在，RNAi也不會改變細胞的表型。siRNA會隨細胞的分裂而被稀釋，細胞的分裂速率決定了RNAi的持續(xù)時間，因此靶細胞類型也會影響siRNA的干擾效率。

4 RNAi基因沉默動力學數學模型及其應用

綜合以上分析，多種不同因素在不同層次上影響RNAi的效率，我們可以將各種關鍵的影響因素綜合起來，建立數學模型，系統(tǒng)深入的分析各種因素的作用，并以此作為參考，合理地設計siRNA治療方案，最終促進RNAi在治療領域的應用。

BartlettD W等［22］第一次構建了包含諸如siRNA載體的生物分布和細胞內siRNA的釋放等機體內控制siRNA運輸過程的各種因素的數學模型，用來進行siRNA介導的基因沉默的動力學研究。模型分析的結果也被用于根據靶蛋白的半衰期和靶細胞分裂的速率來制定用藥方案，通過重復的siRNA注射來誘發(fā)持續(xù)的基因沉默效應。Bartlett D W等［23］還進一步將他們的數學模型用于多項體內和體外的以陽離子環(huán)糊精為基礎的siRNA納米顆粒的基因沉默研究，用以提供更多的信息幫助設計更為有效的siRNA運輸策略。

Vandenbroucke R E等［24］通過對數學模型的分析建立了體內siRNA按時間控制釋放入細胞質的方法。他們運用帶陽離子的能被生物降解的多聚β氨基酯類與帶負電荷的siRNA形成納米大小的靜電復合體，通過內吞作用攝入細胞內。細胞內陽離子聚合物被水解，它們降解產物的積累會增加內吞小泡內的滲透壓。當超過一定的壓力極限時，內吞小泡會破裂。據猜測，聚合物的降解速率和單個內吞小泡內聚合物的數量會控制內吞小泡膜上滲透壓的增長速率，因此，并不是所有的內吞小泡在同一時間破裂。通過這種方式，siRNA可依賴于聚合物的降解不斷地釋放到細胞質中，引起較長久的基因沉默效率。

與以上的方法相似，Raemdonck K等［25］還設計了浸有siRNA的微膠，通過水凝膠交聯(lián)的水解引起其內包含的siRNA按時間控制釋放。根據水凝膠的特性，siRNA的釋放時間可以被隨機調整，可以是幾小時，幾天，甚至幾個星期。因為這種凝膠可被靶細胞攝取，它們可以作為細胞內儲存siRNA的倉庫，緩慢地降解，并釋放其內包含的siRNA，引起較長久的基因沉默效應。

5 展望

RNAi技術由于其高效性和高度特異性，已成為頗為理想的細胞水平基因敲除工具，并迅速成為后基因組時代功能基因組學研究中不可或缺的重要手段。然而，在RNA干擾試驗積累的經驗中發(fā)現(xiàn)，在RNAi發(fā)揮基因沉默效能的過程中，從siRNA類型的選擇、siRNA向體內的遞送直至siRNA進入細胞產生干擾效應等各個環(huán)節(jié)，許多因素都會直接或間接的影響最終的沉默效率和沉默時間。隨著對這些因素的深入研究，必將會一一克服所有的困難和障礙，使RNAi技術在不久的將來得到普遍的應用。

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