李 超， 胡建偉， 鄧名榮， 朱紅惠

(1.塔里木大學(xué) 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300; 2.廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 廣東 廣州 510070)

0 引 言

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶STPK(serine-threonine protein kinase)廣泛存在于真核生物中，在ATP等磷酸供體的存在下，能特異地使底物蛋白中絲氨酸或蘇氨酸殘基上的羥基磷酸化而激活底物蛋白，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)育及生理分化等多種重要的生命過(guò)程.目前研究顯示STPK不僅存在于真核生物中，在原核生物中也同樣存在，如黃色粘球菌(Myxococcusxanthus)[1]，天藍(lán)鏈霉菌(StreptomycescoelicolorA3(2))[2]，無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)[3]等.

鏈霉菌不僅能產(chǎn)生豐富的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)還具有復(fù)雜的發(fā)育周期.對(duì)鏈霉菌的代表種天藍(lán)鏈霉菌A3(2)的基因組測(cè)序結(jié)果表明，該菌存在約44個(gè)可能的STPK[4]，這提示STPK可能對(duì)該菌的形態(tài)發(fā)育、次級(jí)代謝調(diào)控等具有重要的影響.AfsK是發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入的一個(gè)鏈霉菌STPK[5]，它在天藍(lán)鏈霉菌A3(2)中與次級(jí)代謝全局性調(diào)控蛋白AfsR組成雙組份系統(tǒng)，調(diào)控放線紫紅素(actinorhodin)、十一烷基靈菌紅素(undecylprodigiosin)等的生物合成[6].進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，PkaG、AfsL等STPK也能使AfsR磷酸化[7]，提示這些STPK都可能參與了次級(jí)代謝的調(diào)控.在灰色鏈霉菌(S.griseus)中存在與afsK高度同源的基因afsK2，該基因參與氣生菌絲的形成，但對(duì)鏈霉素(streptomycin)的生物合成沒(méi)有影響[8]，這說(shuō)明高度同源的STPK在不同鏈霉菌中可參與不同的生命活動(dòng)，也從側(cè)面反映了STPK在鏈霉菌的生命活動(dòng)過(guò)程中扮演了多樣化的角色.

榴菌素GRA(Granaticin)與放線紫紅素同屬苯并異色滿醌BIQ(Benzoisochromanequinone)類抗生素，均具有抗菌、抗腫瘤等生物活性.早期從紫紅鏈霉菌(S.violaceoruberTü22)中克隆測(cè)序了榴菌素的生物合成基因簇，發(fā)現(xiàn)其左翼存在一個(gè)可能編碼STPK的基因gra-orf7，該基因與天藍(lán)鏈霉菌A3(2)中的PkaA存在較高同源性[9]，與此同時(shí)，在多個(gè)完成基因組測(cè)序的鏈霉菌，如委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(S.venezuelae)ATCC 10712、灰黃鏈霉菌(S.flavogriseus)ATCC 33331、灰色鏈霉菌灰色亞種(S.griseussubsp.griseus)NBRC 13350、阿維鏈霉菌(S.avermitilis)MA-4680、冰城鏈霉菌(S.bingchenggensis)BCW-1、瘡痂病鏈霉菌(S.scabiei)87.22等中也發(fā)現(xiàn)同源基因.同源基因的普遍存在，提示其可能參與了重要的生命活動(dòng)過(guò)程，但其具體生理功能如何，目前仍不明確.

近年，塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從熱帶原始森林土壤中分離獲得一株鏈霉菌新種——粵藍(lán)鏈霉菌(S.vietnamensis)[10]，該菌能夠產(chǎn)生榴菌素[11].前期，我們測(cè)定了該菌榴菌素生物合成基因簇的全長(zhǎng)序列[12]，并首次成功建立了榴菌素產(chǎn)生菌(粵藍(lán)鏈霉菌)的有效遺傳轉(zhuǎn)化體系[13].本研究在此基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)基因敲除，對(duì)gra-orf7這一可能的STPK基因的生理功能進(jìn)行初步研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本研究所涉及的菌株，質(zhì)粒和引物見表1.

表1 參試菌株、質(zhì)粒和引物

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；pCR2.1 TA克隆試劑盒購(gòu)自上海英駿生物技術(shù)有限公司；IPTG、X-Gal、限制性核酸內(nèi)切酶等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；萘啶酮酸(Nalidixic acid，Nali)、阿普拉霉素(Apramycin，Apra)為Sigma產(chǎn)品；氨芐霉素(Ampicillin，Amp)、卡那霉素(Kanamycin，Kan)、氯霉素(Chloramphenicol，Cml)等均為常規(guī)產(chǎn)品.LB、SOB、YEME、YD、NA、2×YT、YMS、高氏一號(hào)等培養(yǎng)基均按標(biāo)準(zhǔn)配方配制.

1.2 gra-orf7基因下游未知序列的克隆與測(cè)序

前期GRA基因簇測(cè)序中已獲得gra-orf7完整基因及下游部分序列，但已知的下游序列長(zhǎng)度并不足以在基因敲除中作為同源臂.為了獲得更長(zhǎng)的下游序列，本研究對(duì)gra-orf7基因及其上、下游已知序列進(jìn)行了同源性分析，通過(guò)BLAST比對(duì)，在同源性較高區(qū)域設(shè)計(jì)引物，以期獲得下游未知序列.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化TA克隆到pCR2.1載體上，酶切驗(yàn)證后送上海英駿公司測(cè)序.

1.3 粵藍(lán)鏈霉菌突變株的構(gòu)建

大腸桿菌和鏈霉菌相關(guān)的分子生物學(xué)操作分別按照文獻(xiàn)[20]和文獻(xiàn)[21]進(jìn)行.突變株MSORF7的構(gòu)建采用PCR-targeting方法[18]進(jìn)行，稍有改動(dòng)如下：根據(jù)gra-orf7基因上下游已知序列設(shè)計(jì)引物ORF7-645和ORF7-4133，利用保真性能高的LA Taq酶從粵藍(lán)鏈霉菌基因組中擴(kuò)增出gra-orf7基因及其上下游共約3.5 kb的片段，TA克隆至載體pCR2.1，得到質(zhì)粒pCR2.1-orf7UD，并將此重組質(zhì)粒作為突變母體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBW25113/pIJ790感受態(tài)細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)化子E.coliBW25113/pIJ790/pCR2.1-orf7UD.

利用引物對(duì)apraF/apraR(下劃線部分與gra-orf7基因上下游序列同源)擴(kuò)增pIJ773質(zhì)粒上包含Apra抗性基因和轉(zhuǎn)移起始序列約1.4 kb片段(aac(3)-IV/oriTcassette)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用電擊法轉(zhuǎn)化至E.coliBW25113/pIJ790/pCR2.1-orf7UD感受態(tài)細(xì)胞.在30℃條件下，λ/RED重組系統(tǒng)將重組質(zhì)粒pCR2.1-orf7UD上的orf7基因替換成aac(3)-IV/oriTcassette，從而獲得pCR2.1-orf7::ApraUD.將質(zhì)粒pCR2.1-orf7::ApraUD轉(zhuǎn)化至E.coliET12567/pUZ8002，得到轉(zhuǎn)化子E.coliET12567/pUZ8002/pCR-orf7::ApraUD，將其與粵藍(lán)鏈霉菌孢子進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，在YD平板上篩選接合子.待YD平板上剛長(zhǎng)出孢子時(shí)，用Apra和萘啶酮酸抗生素覆蓋平板，直到平板上長(zhǎng)出接合子.隨機(jī)挑取若干接合子，點(diǎn)接轉(zhuǎn)移至含有Apra和Kan以及只含Apra的兩種NA平板上，挑取單一抗性(KanS、ApraR)的接合子，即雙交換接合子.

1.4 粵藍(lán)鏈霉菌突變株基因型驗(yàn)證及表型分析

1.4.1 突變株的基因型驗(yàn)證

得到雙交換接合子后，提取其基因組DNA，利用PCR方法進(jìn)行基因型驗(yàn)證.PCR采用4條引物ApraF、ApraR、ORF7-645和ORF7-4133等組合成的4對(duì)引物，即：ApraF/ApraR、ORF7-645/ORF7-4133、ApraF/ ORF7-645、ApraR/ ORF7-4133等進(jìn)行驗(yàn)證.

1.4.2 突變株菌落形態(tài)分析

在多種培養(yǎng)基，如YD、YEME、高氏一號(hào)、MM、P2等中，觀察突變株的菌落形態(tài).取粵藍(lán)鏈霉菌突變株與野生株甘油種各50μL，分別培養(yǎng)于5 mL含Apra的YEME液體培養(yǎng)中，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng).吸取1 mL菌液于1.5 mL無(wú)菌離心管，5 000 rpm離心，棄去上清，1 mL無(wú)菌水重懸菌體.用接種環(huán)進(jìn)行劃線.30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài).

1.4.3 突變株孢子微觀形態(tài)分析

掃描電鏡觀察粵藍(lán)鏈霉菌孢子微觀形態(tài)特征.YD培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的粵藍(lán)鏈霉菌采用戊二醛固定法處理.將鏈霉菌孢子用3%戊二醛固定5 h，依次用PBS，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇，90%乙醇，無(wú)水乙醇處理，再用叔丁醇置換，冷凍干燥后，進(jìn)行電鏡觀察.

1.4.4 突變株產(chǎn)色(榴菌素)能力分析

利用比色法對(duì)突變株的產(chǎn)色能力進(jìn)行測(cè)定.挑取粵藍(lán)鏈霉菌突變株與野生株單菌落，分別培養(yǎng)于5 mL的YEME液體培養(yǎng)基中，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng).吸取1 mL菌液于1.5 mL無(wú)菌離心管，5 000 rpm離心，棄去上清，用1 mL無(wú)菌水重懸菌體，采用比色法進(jìn)行相對(duì)定量.以相同的接種量接于30 mL YEME液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃，170 rpm條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù).產(chǎn)色后，每小時(shí)取一次樣.從培養(yǎng)液中吸取300μL菌液，12 000 rpm離心1 min，取上清，測(cè)定580 nm波長(zhǎng)處的光吸收值.以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，光吸收值(OD580)為縱坐標(biāo)，繪制色素生產(chǎn)曲線.

2 結(jié)果與分析

2.1 gra-orf7基因下游序列的克隆與測(cè)序

對(duì)gra-orf7基因的BLAST分析表明，在多個(gè)完成基因組測(cè)序的鏈霉菌中存在同源基因，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)其上下游序列在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌、灰色鏈霉菌灰色亞種、冰城鏈霉菌等中也存在較高同源性，且該區(qū)域中相鄰基因間相對(duì)位置相同(圖1).將委內(nèi)瑞拉鏈霉菌的SVEN-3648基因與灰色鏈霉菌灰色亞種、冰城鏈霉菌等的相應(yīng)同源基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該基因序列高度保守，多個(gè)區(qū)域序列同源率達(dá)100%.因此，在該3種鏈霉菌的序列一致區(qū)域設(shè)計(jì)了上游引物orf7Fs，與根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的下游引物orf7Rs組成引物對(duì)，以粵藍(lán)鏈霉菌野生型菌株基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1).電泳顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物約為1.5 kb，與預(yù)期大小相近(圖2a).將TA克隆后得到的重組質(zhì)粒pCR-orf7D進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖2b),并送英駿公司測(cè)序.對(duì)測(cè)序結(jié)果分析表明，該擴(kuò)增產(chǎn)物是粵藍(lán)鏈霉菌榴菌素基因簇側(cè)翼基因gra-orf7的下游區(qū)域.

圖1 gra-orf7基因上、下游同源性比較及引物設(shè)計(jì)

圖2 粵藍(lán)鏈霉菌gra-orf7基因下游區(qū)域的PCR擴(kuò)增及其重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.2 突變株的構(gòu)建及基因型驗(yàn)證

Escherichia-Streptomyce屬間接合轉(zhuǎn)移操作之后大約12 h，在YD培養(yǎng)基平板上覆蓋Apra和Nali.30 ℃培養(yǎng)2 d后，從中挑取的表現(xiàn)單一抗性表型(KanS、ApraR)接合子數(shù)目約占10%.雙交換接合子經(jīng)擴(kuò)繁后，提取其基因組DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證.瓊脂凝膠電泳檢測(cè)顯示708 bp(ApraF/ApraR)、3 511 bp(ORF7-645/ORF7-4 133)、1 861 bp(ApraF/ORF7-645)、2 358 bp(ApraR/ORF7-4 133)條帶(圖3)，其中，M，分子量標(biāo)準(zhǔn)DS5000；1～4分別為ApraF/ApraR、ORF7-645/ORF7-4133、ApraF/ORF7-645、ApraR/ORF7-4133的PCR產(chǎn)物，結(jié)果符合預(yù)期，提示突變株構(gòu)建成功.

圖3 粵藍(lán)鏈霉菌gra-orf7突變株基因型的PCR驗(yàn)證

2.3 突變株表型分析

2.3.1 突變株菌落形態(tài)分析

突變株在YD、YEME、高氏一號(hào)、MM、P2等培養(yǎng)基平板上，仍然能夠產(chǎn)藍(lán)色素，即榴菌素，且具有產(chǎn)孢的能力，菌落形態(tài)與野生株無(wú)顯著差異(圖4).

圖4 粵藍(lán)鏈霉菌突變株MSORF7與野生株菌落形態(tài)比較

2.3.2 突變株孢子微觀形態(tài)分析

通過(guò)掃描電鏡的觀察，其孢子形態(tài)與野生株也基本一致(圖5).

圖5 掃描電鏡對(duì)粵藍(lán)鏈霉菌突變株與野生株孢子形態(tài)觀察

2.3.3 突變株產(chǎn)色(榴菌素)能力分析

在YEME液體培養(yǎng)基中，對(duì)照野生株在培養(yǎng)到11 h時(shí)開始產(chǎn)生色素(榴菌素)，而突變株約在12 h時(shí)才開始產(chǎn)色，但突變株在培養(yǎng)約19 h時(shí)，色素產(chǎn)量與野生株基本相同(圖6).在多次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，均可觀察到突變株較野生株延遲產(chǎn)色的現(xiàn)象，說(shuō)明這一變化特征較為穩(wěn)定.

圖6 粵藍(lán)鏈霉菌gra-orf7突變株與野生株在YEME液體培養(yǎng)基產(chǎn)色比較

3 結(jié)論與探討

基因敲除是研究目標(biāo)基因功能的主要手段之一，本研究對(duì)粵藍(lán)鏈霉菌中一個(gè)可能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(STPK)編碼基因gra-orf7進(jìn)行了體內(nèi)敲除，PCR基因型驗(yàn)證結(jié)果顯示，gra-orf7缺失突變株構(gòu)建成功.突變株在菌落形態(tài)、產(chǎn)孢能力、孢子形態(tài)以及色素(榴菌素)最終產(chǎn)率等方面與野生株無(wú)顯著差異，這些結(jié)果似乎暗示gra-orf7在粵藍(lán)鏈霉菌的發(fā)育分化，和榴菌素的生物合成過(guò)程中并不扮演重要角色.然而，突變株的產(chǎn)色延遲現(xiàn)象在重復(fù)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中均能觀察到，該表型變化應(yīng)與gra-orf7基因的失活直接相關(guān)，這說(shuō)明gra-orf7基因編碼的STPK在粵藍(lán)鏈霉菌中具有生物學(xué)功能.

第三，“免費(fèi)退貨政策”為那些無(wú)法親身體驗(yàn)真實(shí)產(chǎn)品的網(wǎng)購(gòu)者提供了一種安全感。在這種情況下，該政策為網(wǎng)絡(luò)買家提供了精神和物質(zhì)上的保障。這項(xiàng)政策鼓勵(lì)更多的留學(xué)生進(jìn)行網(wǎng)上購(gòu)物，因?yàn)樗麄儧](méi)有任何后顧之憂。最后一點(diǎn)也極其重要，那就是隱私和安全問(wèn)題已經(jīng)成為網(wǎng)絡(luò)消費(fèi)者最關(guān)心的問(wèn)題之一。根據(jù)圖5的數(shù)據(jù)，84.9%的留學(xué)生認(rèn)為安全是最重要的考慮因素。對(duì)于所有的電子零售商，應(yīng)該加強(qiáng)他們的在線交易和支付系統(tǒng)，以防丟失隱私、信用卡交易和身份盜竊，并為所有在線購(gòu)物者提供一個(gè)安全可靠的在線交易平臺(tái)。最后，作者還建議政府、供應(yīng)商、零售商和其他參與者，多方共同解決安全問(wèn)題。因?yàn)橐揽繂畏矫娴牧α亢茈y取得令人滿意的結(jié)果。

突變株產(chǎn)色(榴菌素)的延遲，卻并不能說(shuō)明gra-orf7基因編碼的STPK直接參與了榴菌素的生物合成.在許多抗生素生物合成基因簇中存在被稱為抗生素合成“分子開關(guān)”的途徑特異性調(diào)控基因[22]，只有當(dāng)途徑特異性調(diào)控基因被激活后，抗生素的生物合成才會(huì)啟動(dòng).在榴菌素的生物合成基因簇中也同樣存在這種途徑特異性調(diào)控基因gra-orf9[9].gra-orf7缺失突變株在產(chǎn)色后,無(wú)論是色素的累積速度和最終產(chǎn)量水平均與野生株無(wú)顯著差別，這說(shuō)明gra-orf7并沒(méi)有直接參與榴菌素的生物合成.產(chǎn)色延遲可能是由于gra-orf7基因的失活,影響到了上游調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致榴菌素生物合成的途徑特異性調(diào)控基因gra-orf9的激活滯后.

STPK是通過(guò)使目標(biāo)蛋白磷酸化而激活目標(biāo)蛋白的.在鏈霉菌中，不同的STPK可能能夠激活同一個(gè)目標(biāo)蛋白.例如，在天藍(lán)鏈霉菌A3(2)中，次級(jí)代謝全局性調(diào)控蛋白AfsR是蛋白激酶AfsK的目標(biāo)蛋白[5]，但PkaG、AfsL等STPK也能使AfsR磷酸化[7].在本研究中，gra-orf7基因編碼的STPK可能參與了與榴菌素生物合成有關(guān)的上游調(diào)控信號(hào)的傳導(dǎo)，但其目標(biāo)蛋白可能也能夠被其它未知的STPK激活，形成某種補(bǔ)償機(jī)制，使得gra-orf7基因的失活，并不能徹底阻斷榴菌素的合成，而是延遲產(chǎn)生.

近期，也有研究者獲得了與我們類似的結(jié)果[23].他們?cè)谘芯刻焖{(lán)鏈霉菌A3(2)的一個(gè)STPK基因pkaF時(shí)發(fā)現(xiàn)，pkaF過(guò)量表達(dá)突變株表現(xiàn)出生長(zhǎng)延遲、完全喪失了產(chǎn)孢和產(chǎn)放線紫紅素的能力，表明pkaF對(duì)天藍(lán)鏈霉菌A3(2)的生長(zhǎng)、發(fā)育分化和次級(jí)代謝有重要的影響；然而pkaF失活突變株在細(xì)胞生長(zhǎng)、氣生菌絲分化、產(chǎn)孢和放線紫紅素的產(chǎn)生等方面與野生株并無(wú)差別，僅產(chǎn)孢和產(chǎn)放線紫紅素的時(shí)間提早了約0.5天.造成這一結(jié)果的原因也可能與本研究類似，即該基因的目標(biāo)蛋白還能夠被其它未知的STPK激活，通過(guò)某種補(bǔ)償機(jī)制，在該基因失活的情況下，菌株仍然能夠維持大致正常的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和次級(jí)代謝過(guò)程.也正是基于這個(gè)原因，雖然gra-orf7缺失突變株的各種表型與野生株無(wú)顯著差別，但并不能排除gra-orf7參與粵藍(lán)鏈霉菌發(fā)育、分化的可能.

鏈霉菌STPK早在1994年即被發(fā)現(xiàn)[24]，此后許多可能的鏈霉菌STPK陸續(xù)被證實(shí),在體外具有絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化活性，然而其體內(nèi)生理功能和作用機(jī)制被闡明的僅有AfsK等極少數(shù)STPK.基因敲除后，突變株的表型常常與野生株相近，是導(dǎo)致其體內(nèi)真實(shí)生理功能難以被發(fā)現(xiàn)的重要原因.本研究雖然暗示了gra-orf7基因編碼的STPK，在粵藍(lán)鏈霉菌中可能參與了與榴菌素生物合成有關(guān)的上游調(diào)控信號(hào)的傳導(dǎo)，但要揭示其生理功能和作用機(jī)制，仍有大量的工作需要展開.例如，體外絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化活性的證實(shí)、體內(nèi)過(guò)量表達(dá)研究、目標(biāo)蛋白的捕獲和鑒定等，這些均有助于我們深入了解gra-orf7基因在粵藍(lán)鏈霉菌中的生理功能.目前，進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中.

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