陳宇 杜勇 李浩渤 張英懷

E-鈣粘蛋白編碼基因定位于16號染色體q22.1附近，是介導上皮細胞間粘連的一種細胞粘附分子，對Ca2+有高度敏感性。在生理條件下E-鈣粘蛋白對維持組織結構形態(tài)、調節(jié)細胞運動及參與維持細胞之間、細胞與基質之間的黏附力都具有重要作用［1］。目前研究認為E-鈣粘蛋白是一種抑癌基因，當其在腫瘤組織中活性正常時，腫瘤細胞不易從原發(fā)灶上脫落，E-cad通過加強細胞間的黏附力及抑制細胞增殖來發(fā)揮抑癌功能;而其活性降低或失活時則導致細胞黏附功能下降從而促進腫瘤細胞轉移。研究表明腫瘤組織中E-鈣粘蛋白的表達下降與腫瘤的分化程度、發(fā)展、淋巴結轉移的發(fā)生及預后密切相關［2］。本研究通過免疫組化的試驗方法檢測E-鈣粘蛋白在口腔鱗狀細胞癌中的表達及與口腔鱗狀細胞癌組織學分級的關系，并進一步探討E-鈣粘蛋作為判斷患者預后標記物和治療靶點的前景。

1 材料與方法

1.1 標本來源 試驗組:收集河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院1991至2009年口腔鱗狀細胞癌蠟塊標本60例(取標本前未經(jīng)任何治療)，其中男38例，女22例;年齡41～77歲，平均年齡58.7歲;高分化31例，中度分化21例，低分化8例;標本均經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī)師閱片后確診。對照組:正?？谇火つそM織40例，均取自囊腫旁及牙槽骨整形手術時切除的正常黏膜組織。其中男25例，女15例;年齡21～68歲，平均年齡40.5歲。

1.2 主要試劑與儀器 試劑:SP免疫組化試劑盒、一抗(購自博士德分裝抗體)、DAB顯色劑、多聚賴氨酸(Poly－L-lysine)防脫片劑均購于河北博海生物有限公司。儀器:LEICA石蠟切片機，ZHPY-型恒溫式附貼切片展片儀(河北醫(yī)科大學)，多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus)、離心機(北京離心機廠，LDZ5-2型)、移液器(德國EPPENDORF)、低溫冰箱(日本三洋，MDF-382E型)、PGB/20-002臺式保溫培育箱(中華人民共和國重慶試驗設備廠)、Olympus PM-10ADS型雙目顯微鏡。

1.3 對照試驗 用已知的E-鈣粘蛋白陽性的腸黏膜標本作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 試驗方法 采用免疫組織化學SP法(過氧化物酶標記的鏈酶卵白素法)。所有標本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟重新包埋后，將每個蠟塊切為5 μm的切片，共切4張，1張HE染色，1張作為陰性對照，1張E-鈣粘蛋白染色。

1.5 結果判定 E-鈣粘蛋白以細胞膜上出現(xiàn)棕黃色膜性染色作為正常表達的陽性標記。而位于細胞漿中或胞膜與胞漿共同有連續(xù)線狀或斑點狀黃色至棕黃色顆粒沉積者為異常陽性表達，無染色者為陰性表達。每張切片隨機計數(shù)10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞。據(jù)陽性細胞百分率判定:(1)陰性:無染色，陽性細胞數(shù)＜25%;(2)弱陽性:胞漿染色淺，陽性細胞數(shù)26% ～50%;(3)中度陽性:胞膜胞漿混合染色，陽性細胞數(shù)51% ～75%;(4)強陽性:胞膜連線狀均勻染色，陽性細胞數(shù)＞75%。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組E-鈣粘蛋白陽性表達比較 E-鈣粘蛋白對照組呈強陽性表達38例(圖1)，呈異常陽性2例，異常陽性率5%;試驗組呈強陽性表達21例，呈異常陽性表達(包括陰性表達)39例(圖2)，異常陽性率65%，顯著高于對照組(χ2=35.72，P＜0.05)。

圖1 E-鈣粘蛋白在正?？谇火つぶ械谋磉_(SP×400)

圖2 E-鈣粘蛋白在口腔鱗狀細胞癌中的表達(SP×400)

2.2 E-鈣粘蛋白的表達馬鱗癌的組織學分級關系 E-鈣粘蛋白的表達與鱗癌的組織學分級具有相關性，鱗癌的分化越低，E-鈣粘蛋白的異常陽性率表達越高(P＜0.05)，而與患者性別、年齡無顯著相關性(P＞0.05)。見表1、2。

表1 E-鈣粘蛋白的陽性表達強度與口腔鱗癌組織學分級的關系例

表2 口腔鱗癌組織中E-鈣粘蛋白的表達與臨床指標的關系 例

3 討論

E-鈣粘蛋白是一類介導細胞間黏附的上皮性鈣依賴性跨膜糖蛋白，基因位于16號染色體長臂，分子量為120 kU。1999年克隆和提純了人類E-Cadherin基因(CDHI)，發(fā)現(xiàn)人類E-cad基因位于16q22.1，含有16個外顯子及15個內(nèi)含子。

E-鈣粘蛋白存在于所有上皮組織中。無論是在胚胎發(fā)育階段還是在成熟組織中E-鈣粘蛋白都起到了調節(jié)細胞識別、細胞間黏附、維持細胞極性、維持組織結構性完整的重要作用。并在胚胎細胞發(fā)育過程中影響細胞的分化，參與器官形成過程。研究人員很早就在小鼠上證明如果破壞E-鈣粘蛋白的基因，胚胎就不能發(fā)育，說明生物早期的組織器官發(fā)生中，E-鈣粘蛋白的功能很關鍵，并有研究推測E-鈣粘蛋白與牙冠釉質形成及牙根發(fā)育有關［3］。

E-鈣粘蛋白是一種重要的細胞黏附分子和信號傳導分子，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黏附系統(tǒng)中發(fā)揮主要作用。做為近年來較為關注的抑癌因子其主要功能為控制細胞移動，研究證明加強細胞間的黏附和抑制細胞增殖則是其實現(xiàn)抑癌功能的兩條途徑。E-鈣粘蛋白的功能下降或喪失則引起腫瘤細胞從原發(fā)部位脫落，這表明E-鈣粘蛋白活性減低與腫瘤的低分化、高侵襲和轉移密切相關［4］。因此E-鈣粘蛋白在抑制腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉移過程中起著重要作用，是預示腫瘤轉移及預后的重要指標之一。

正?？谇火つぶ?，E-鈣粘蛋白在胞漿合成后，然后彌漫在胞膜，以膜性表達為主，且主要位于基底層和棘層，這與本試驗結果相一致。本試驗中40例正常口腔黏膜標本有38例呈強陽性表達，呈棕黃色膜性染色，且E-cad主要表達于基底層至棘細胞層的細胞膜。

口腔鱗狀細胞癌是口腔中的一種上皮性的惡性腫瘤，其特征是細胞間橋出現(xiàn)和角蛋白形成［5］。近年來病理學研究表明，細胞間橋的出現(xiàn)和鱗癌包括口腔鱗狀細胞癌的分化是相關的，高分化鱗癌中細胞間橋出現(xiàn)較多，細胞的黏附性較強，侵襲性及轉移力較弱，因此E-鈣粘蛋白的表達較強。而中度分化和低度分化的口腔鱗狀細胞癌中細胞間橋較少見，細胞間黏附因性差，具有較強的侵襲性轉移力。因此E-鈣粘蛋白的表達異?；蜉^弱甚至不表達。本試驗中60例口腔鱗狀細胞癌標本呈強陽性表達21例，呈現(xiàn)異常陽性表達39例，異常陽性率為65%顯著高于對照組，甚至在低分化鱗癌中出現(xiàn)62.5%的陰性表達。

Yamada等［6］用免疫組化方法檢測18例口腔鱗狀細胞癌中E-鈣粘蛋白表達，發(fā)現(xiàn)比正?？谇火つっ黠@減少甚至缺失，并且這種異常表達與口腔鱗狀細胞癌的TNM分期、發(fā)生淋巴結轉移和組織學分型相關。Chow等［7］對口腔鱗狀細胞癌中E-鈣粘蛋白的表達進行研究，顯示E-鈣粘蛋白的表達下降或者消失導致腫瘤的侵襲性增強，預后差，同時與口腔鱗狀細胞癌的TNM分期明顯相關，E-鈣粘蛋白的表達的下降使腫瘤更容易復發(fā)。Yokoyama［8］通過研究在體外比較陰性表達E-鈣粘蛋白和陽性表達E-鈣粘蛋白的口腔鱗狀細胞癌細胞的侵襲力，發(fā)現(xiàn)陰性表達E-鈣粘蛋白的口腔鱗狀細胞癌細胞有更強的侵襲能力。因此，目前研究證實E-鈣粘蛋白與口腔鱗狀細胞癌的進展密切相關，是判斷口腔鱗狀細胞癌生物學行為和預測轉移趨勢有價值的指標。可以作為判定預后及指導治療的指標，可能會成為抗轉移治療的靶點。

1 Morin PJ.Beta-catenin signaling and cancer.Bioesays，1999，21:1021-1030.

2 劉健，浦劍虹，葛自力，等.E-cda、CD44V6在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達及其相關性研究.實用口腔醫(yī)學雜志，2005，21:67-70.

3 李紓，劉琳.E-鈣粘蛋白在出生后小鼠牙齒發(fā)育中的表達和意義.牙體牙髓牙周病學雜志，2004，14:670-673.

4 Stockinger A，Eger A，Wolf J.E-cadherin regulates cell growth by modulating proliferation-dependent beta-catenin transcriotional activity.J Cell Biol，2001，154:1185-1196.

5 唐瞻貴.E-cadherin基因蛋白在口腔疣狀癌中的表達.湖南醫(yī)科大學學報，2003，28:206-208.

6 Yamada K，Jordan R，Mori M，et al.The relationship between E-cadherin expression，clinical stage and tumor differentiation in oral squamous cell carcinoma.Oral Dis，1997，3:82-85.

7 Chow V，Yuen AP，Lam KY，et al.Acomparative study of the clinicopathological significance of E-cadherin and catenins expression in the surgical management of oral tongue carcnoma.J Cancer Res Clinoneol，2001，127:59-63.

8 Yokoyama K，Kamata N，Hayashi E，et al.Reverse correlation of E-cadherin and snai1 express in oral squamous cell careinoma cells in vltro.O-ral Oncol，2001，37:65-71.