陳霞 劉蕾 牛國(guó)超 梁育飛 張曉嵐

肝硬化被視為原發(fā)性肝癌(HCC)的一種癌前疾病。肝癌的篩查方法包括血清甲胎蛋白(AFP)檢測(cè)、B超及放射學(xué)檢查等，但是AFP檢測(cè)對(duì)肝癌診斷的陽(yáng)性率差別很大。CD105是一種增生相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜抗原。CD105參與了血管生成的某些過(guò)程，因此可以將CD105作為腫瘤新生血管標(biāo)記物。CD105參與血管生成，是新生血管的標(biāo)志，因此，可以預(yù)見(jiàn)CD105在惡性腫瘤的診斷、治療和預(yù)后中發(fā)揮重要的作用。HCC患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的測(cè)定及在預(yù)測(cè)HCC的價(jià)值筆者尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞和血清AFP在肝硬化及HCC患者的表達(dá)水平，探討HCC患者與肝硬化患者及正常對(duì)照間外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的差異及其意義，判定CD105在肝硬化肝癌早期診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn):①肝硬化病例均符合2000年9月西安中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)會(huì)分會(huì)、肝炎后肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn);②HCC患者符合2001年9月第八屆全國(guó)肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議通過(guò)的原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn);③臨床資料齊全，包括肝功能、凝血常規(guī)檢測(cè)，B超或CT影像學(xué)檢查。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他部位腫瘤;②風(fēng)濕免疫性疾病［1］;③妊娠女性;④心肌梗死急性期［1］。

1.1.3 病例資料 選取滄州市中心醫(yī)院住院肝硬化患者60例為肝硬化組，男44例，女16例;平均年齡(55±12)歲。HCC患者40例為HCC組，男30例，女10例;平均年齡(54±8)歲。另外，選取健康志愿者30例作為正常對(duì)照組，男14例，女16例;平均年齡(59±10)歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集:清晨空腹抽血后，樣本分送CD105和AFP檢測(cè)。

1.2.2 CD105 測(cè)定:抽取抗凝靜脈全血 1 ml，取其中 100 μl全血置于一試管中，加入 20 μlγ1 對(duì)照液，后加入 20 μl CD45;另取一試管 100 μl全血，加入 20 μl CD105，再加入 20 μl CD45，隨后2管避光放置20 min，各加入溶血素1 ml，再避光放置10 min，以1500 r/min的速度離心5 min，棄上清液，各加緩沖液2 ml，同一速度再次離心5 min，棄上清液，再加入400 μl緩沖液后上機(jī)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以Cell Quest軟件獲取分析數(shù)據(jù)，定量分析每管樣品中10 000個(gè)細(xì)胞，以CD105+細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，收集數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目，判定結(jié)果。檢測(cè)外周血中CD105陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)率。

1.2.3 AFP測(cè)定:采用微粒子捕捉免疫發(fā)光技術(shù)(MEIA)，酶標(biāo)抗體采用堿性磷酸酶(ALP)作為標(biāo)記物，取血清的上清液1 ml，置于測(cè)量杯中，儀器自動(dòng)吸取樣品 50 μl，液相試劑250 μl，固相試劑 250 μl，37℃ 溫水浴 7.5 min，沖洗后，自動(dòng)加入反應(yīng)試劑(堿性雙氧水)，激發(fā)反應(yīng)，其發(fā)光強(qiáng)度與樣品濃度成正比。直接讀取結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞變化 HCC組外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞水平高于肝硬化組與正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。肝硬化組外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞水平高于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組CD105陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)%，±s

表1 3組CD105陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)%，±s

注:與HCC 組比較，*P ＜0.05

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2.2 HCC患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的測(cè)定與血清AFP水平比較 HCC患者的血清AFP的表達(dá)水平較肝硬化組和正常對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其中AFP＞400 ng/ml的HCC患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞水平顯著高于AFP＜400 ng/ml者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表2、3。

表2 3組血清AFP的表達(dá)ng/ml，±s

表2 3組血清AFP的表達(dá)ng/ml，±s

注:與HCC 組比較，*P ＜0.01

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表3 不同AFP等級(jí)的肝癌中CD105陽(yáng)性細(xì)胞比例與肝硬化的比較%，±s

表3 不同AFP等級(jí)的肝癌中CD105陽(yáng)性細(xì)胞比例與肝硬化的比較%，±s

注:與HCC AFP＜400 ng/ml組比較，*P ＜0.01;與肝硬化組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

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2.3 HCC患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的水平與腫瘤大小的關(guān)系 腫瘤直徑＞5 cm的患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞水平高于腫瘤直徑≤5 cm患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表4。

表4 不同等級(jí)直徑肝癌CD105陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)比例%，±s

表4 不同等級(jí)直徑肝癌CD105陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)比例%，±s

注:與直徑≤5 cm比較，*P ＜0.01

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3 討論

HCC是一種發(fā)病率及病死率均很高的惡性腫瘤。早期診斷、早期治療才能延長(zhǎng)肝癌患者的生存期，肝癌缺乏特異的臨床表現(xiàn)，早期診斷率低，許多患者診斷時(shí)已發(fā)展為進(jìn)展期肝癌。目前臨床上常用的肝癌早期篩查手段是AFP檢測(cè)、B超和影像學(xué)檢查等。AFP是目前診斷肝癌最常用的血清學(xué)指標(biāo)，AFP的特異性較高，但敏感性不高，因此，尋找一個(gè)敏感性更高的血清診斷學(xué)指標(biāo)對(duì)提高早期診斷率有一定幫助。

CD105是血管內(nèi)皮細(xì)胞上可以結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的受體蛋白，是由2個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約為9.5萬(wàn)的單體聚合而成。有學(xué)者［2］發(fā)現(xiàn)了主要定位于各組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的endoglin，并且在眾多正常組織間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞上檢測(cè)到CD105。近幾年檢測(cè)腫瘤組織中新生血管內(nèi)皮表面的TGF-β受體，使得CD105與腫瘤的生長(zhǎng)和預(yù)后密切相關(guān)。CD105的存在，為提純內(nèi)皮細(xì)胞或?yàn)閬?lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤分類提供了一個(gè)可能有效的方法［3］。

CD105能調(diào)節(jié)內(nèi)皮-間質(zhì)間的信號(hào)傳遞，參與血管新生過(guò)程，而血管新生是腫瘤普遍存在的特征，與腫瘤組織的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在不同組織來(lái)源的惡性腫瘤中，CD105在腫瘤組織及其周圍血管的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)［4］，且CD105主要在未成熟的血管內(nèi)皮表達(dá)，少數(shù)情況下可在腫瘤細(xì)胞中弱表達(dá)［5］，進(jìn)一步的研究表明，Endoglin無(wú)論在體內(nèi)和體外都過(guò)表達(dá)新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并與增殖指標(biāo)cyclin A、ki-67過(guò)表達(dá)直接相關(guān)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的標(biāo)志，與內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物如CD31、CD34、Ⅷ因子相關(guān)抗原等相比，CD105陽(yáng)性細(xì)胞僅在新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞上高表達(dá)，而在正常組織的血管上無(wú)表達(dá)或弱表達(dá)［6，7］。

肝癌是一種富含血管的腫瘤，血管形成是肝癌生長(zhǎng)、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的重要條件。Takahashi等［8］發(fā)現(xiàn)，直腸癌、乳腺癌等發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者血清S-CD105的表達(dá)水平顯著高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，并發(fā)現(xiàn)化療能降低血清S-CD105的含量，從而提出血清S-CD105作為血管生成的標(biāo)志，可以用來(lái)預(yù)測(cè)惡性腫瘤患者疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性。Akagi等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸腺瘤由輕度、重度不典型增生至腺癌發(fā)展的過(guò)程中，CD105標(biāo)記的MVD值逐漸升高，表明CD105在預(yù)測(cè)結(jié)直腸腺瘤癌變的過(guò)程中是有效指標(biāo)，提示CD105有助于早期診斷疾病，及時(shí)治療。

盡管存在著一定程度的假陽(yáng)性及假陰性，AFP仍然是目前公認(rèn)的肝癌最佳診斷標(biāo)志物，在HCC早期診斷中具有重要價(jià)值。AFP是胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生的一種特殊蛋白質(zhì)，胎兒出生后不久即逐漸消失，是目前應(yīng)用最廣泛的早期診斷和篩查肝癌的指標(biāo)，但其敏感性和特異性均存在不如意地方，尤其是血清中AFP水平與腫瘤大小呈正相關(guān)，對(duì)小腫瘤不敏感，限制了其在肝癌早期診斷中的價(jià)值［10］。于興等［11］報(bào)道，有27.7%的良性肝病患者血清AFP水平升高。

在乙型肝炎——肝硬化——肝癌的發(fā)展過(guò)程中，乙肝病毒通過(guò)整合到宿主的DNA中，促進(jìn)血管生成。在惡性腫瘤形成中，TGF-β主要起到了促增殖作用。CD105通過(guò)激活TGF-β/ALK1信號(hào)傳導(dǎo)途徑，同時(shí)間接抑制TGF-β/ALK5信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤血管生成。在腫瘤缺血缺氧時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞開(kāi)始裂解血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜上的CD105，釋放可溶性CD105，使原有腫瘤部位的血管內(nèi)皮受損，內(nèi)皮細(xì)胞間的連接松散、擴(kuò)大，可使腫瘤細(xì)胞更好的釋放入血，進(jìn)而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的水平顯著高于肝硬化組及正常對(duì)照組，考慮與以下因素有關(guān):(1)肝癌患者TGFβ1過(guò)度調(diào)節(jié)及CD105在有活性的肝臟星狀細(xì)胞表達(dá);(2)CD105在內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，而內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要，起著決定性作用。

AFP是由胚胎期卵黃囊和肝細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白。肝癌患者體內(nèi)AFP基因重新表達(dá)，其表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生于轉(zhuǎn)錄水平。大多數(shù)肝癌患者血清AFP顯著升高，但仍有10% ～30%的患者呈陰性。AFP必須聯(lián)合影像學(xué)才能診斷肝癌，但是AFP聯(lián)合影像學(xué)診斷也仍有一定的漏診率。本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)顯著高于肝硬化患者;AFP＞400 ng/ml的肝癌患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)水平顯著高于 AFP＜400 ng/ml者;AFP＜400 ng/ml的患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)顯著高于肝硬化組，提示CD105可能作為AFP不滿足診斷標(biāo)準(zhǔn)的肝癌患者補(bǔ)充診斷指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)外周血CD105在肝硬化進(jìn)展為肝癌過(guò)程中的關(guān)系緊密，這也從側(cè)面反映了血管生成在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要性。我們通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞和AFP聯(lián)合檢測(cè)可提高肝癌的陽(yáng)性檢出率，減少漏診率，提高診斷的準(zhǔn)確性。

惡性腫瘤的生長(zhǎng)依賴于營(yíng)養(yǎng)血管的不斷生成。一旦腫瘤直徑超過(guò)2 mm，就有毛細(xì)血管的生成，使腫瘤獲得足夠的血供和營(yíng)養(yǎng)。腫瘤新生血管結(jié)構(gòu)缺乏完整性，管壁薄弱，更容易被腫瘤細(xì)胞穿透，而且腫瘤呈膨脹浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，會(huì)對(duì)周圍組織產(chǎn)生壓力，這樣可使腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入血液循環(huán)，形成轉(zhuǎn)移灶。隨著腫瘤體積的增大，新生血管形成更多，更容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。由于CD105在惡性腫瘤中的表達(dá)可以反映出腫瘤血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞活躍情況，所以CD105的高表達(dá)可作為惡性腫瘤患者轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷的指標(biāo)之一。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的水平顯著高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，分期越晚，外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的水平越高。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑＞5 cm的肝癌患者外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的水平高于腫瘤直徑＜5 cm的肝癌患者的CD105陽(yáng)性細(xì)胞的水平。腫瘤的局部復(fù)發(fā)率隨體積的增大而增加，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)亦越多。推測(cè)外周血CD105陽(yáng)性細(xì)胞的水平升高可能與肝癌患者腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系，很可能對(duì)預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有一定價(jià)值，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

CD105在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，同時(shí)也與腫瘤的預(yù)后有關(guān)。CD105在HCC的診斷與治療方面起著重要作用，在靶向治療腫瘤的今天，CD105展現(xiàn)出了一定的臨床應(yīng)用前景。

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