巴雅爾 張生彬 佟豪

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是人體常見的惡性腫瘤之一，我國HCC發(fā)病率很高，其病死率居消化道腫瘤前列，其中肝癌浸潤、肝內(nèi)及門靜脈轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良及患者死亡的主要原因。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對HCC發(fā)病機(jī)制的研究也逐步深入。肝癌的生成涉及許多基因的變化，基因變化的積累引起控制細(xì)胞生長和分化機(jī)制的紊亂，各種基因參與細(xì)胞增殖、凋亡和DNA復(fù)制等過程，其表達(dá)的失控最終導(dǎo)致HCC的發(fā)生和發(fā)展。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測肝癌組織、肝硬化、正常肝組織中P53、P63的表達(dá)，探討P53、P63與原發(fā)性肝癌臨床病理特征的關(guān)系以及兩者之間的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 2005年9月至2010年9月我院普外科肝癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本46例，另選腫瘤旁肝硬化組織包埋蠟塊20例和肝良性病切除肝組織12例作為對照組，4 μm厚度切片待測。其中肝癌患者52例，男37例，女15例;年齡21～72歲。所有病例均經(jīng)術(shù)后病理證實。P53一抗鼠人單克隆抗體，P63一抗鼠抗人單克隆抗體，濃縮型，工作濃度1∶50，EliVisionTM plus試劑盒，SP法即用型免疫組織化學(xué)二抗試劑盒，DAB顯色劑(DAB-0031)等均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法 應(yīng)用免疫組化法檢測:全部標(biāo)本取材后均常規(guī)用甲醛固定、石蠟包埋，制成4 μm連續(xù)切片后，進(jìn)行免疫組EliVisionTM plus法染色，主要步驟:切片脫蠟至水，高壓修復(fù)1.5 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20 rain，正常非免疫血清封閉30 rain，滴加1抗在室溫孵育1 h，滴加50 μl聚合物增強(qiáng)劑A，室溫孵育20 rain;滴加50 μl酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物B，室溫孵育30 min;新鮮DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以已知陽性反應(yīng)片作陽性對照，陰性對照采用PBS替代一抗進(jìn)行同步染色。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn) 顯微鏡下隨機(jī)選取4個高倍視野共記錄200個肝癌細(xì)胞，(1)按顯色組織所占的面積比例評分:(無陽性細(xì)胞或≤5%為0分，5% ～25%計為1分，26% ～50%計為2分，＞50%計為3分);(2)同時對染色強(qiáng)度進(jìn)行評分:(0分為無染色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色);每例標(biāo)本的積分為［(1)+(2)］/2，按積分高低分為:0分為陰性(－)，0.5～1分為弱陽性(+)，1.5 ～2 分為陽性(++)，2.5～3分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，定性資料率的比較用χ2檢驗，非參數(shù)檢驗應(yīng)用spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P63表達(dá)檢驗結(jié)果 P63在HCC組織中的陽性表達(dá)30例，呈彌漫性表達(dá)，主要位于細(xì)胞核，在高倍鏡下可見顯色主要位于核膜，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。表達(dá)率65.2%，其中6例呈(+)，13例呈(++)，11例呈(+++);肝硬化組織和正常肝組織中均未見表達(dá)，肝癌與癌旁肝硬化組織中P63蛋白的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=44.499，P=0.000)。HCC 中高分化組陽性表達(dá)率36.4%，中分化組陽性表達(dá)率68.2%，低分化組陽性表達(dá)率84.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.336，P=0.042);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率80.8%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率45.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.376，P=0.012);而P63的陽性表達(dá)率與年齡、性別、腫瘤大小及有無門脈癌栓浸潤無明顯相關(guān)(P＞0.05)。見表1、2。

表1 P63在正常肝組織、肝硬化組織和肝癌組織中的表達(dá) 例

表2 P63在肝癌中的表達(dá)與臨床病理特點的相關(guān)性 例

2.2 P53表達(dá)檢驗結(jié)果 P53呈彌漫性表達(dá)，主要位于細(xì)胞核，在高倍鏡下可見顯色主要位于核膜，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。在肝癌、肝硬化及正常肝組織的陽性表達(dá)率分別是78.3%、10%和0，肝癌與癌旁肝硬化組織中P53蛋白的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=46.906，P=0.000)，其中10 例呈(+)，14例呈(++)，12例呈(+++);HCC中高分化組陽性表達(dá)率45.5%，中分化組陽性表達(dá)率86.4%，低分化組陽性表達(dá)率92.30%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.435，P=0.015);有門脈癌栓浸潤組陽性表達(dá)率100%，無門脈癌栓浸潤組陽性表達(dá)率33.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.634，P=0.000);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率96.2%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率55.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.964，P=0.003);而 P53 表達(dá)率與年齡、性別及腫瘤大小無明顯相關(guān)(P＞0.05)。見表3、4。

表3 P53在正常肝組織、肝硬化組織和肝癌組織中的表達(dá) 例

表4 P53在肝癌中的表達(dá)與臨床病理特點的相關(guān)性 例

2.3 HCC中P53與P63蛋白表達(dá)的相關(guān)性 HCC中P53與P63蛋白表達(dá)無相關(guān)性(r=0，P=0.895)。見表5。

表5 HCC中P53與P63蛋白表達(dá)的關(guān)系 n=46，例

3 討論

近年來迅速發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，能動態(tài)、整體、定量地考察疾病發(fā)生發(fā)展過程中全部蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的變化，對于探討疾病機(jī)制、尋找疾病診斷的特異性標(biāo)志物和藥物治療的靶標(biāo)來說，是一種有效的高通量的研究模式，可獲得一些傳統(tǒng)手段無法得到的新蛋白標(biāo)志物、新關(guān)鍵分子，極大地豐富診斷標(biāo)志物的選擇組合及復(fù)雜致病機(jī)制的全面闡明。

P53是一種重要的抑癌基因之一，在人類多種腫瘤細(xì)胞中可發(fā)生突變［1］，P53基因的突變產(chǎn)物P53蛋白是一種腫瘤促進(jìn)因子，它的集聚與HCC的增殖和進(jìn)展密切相關(guān)，以免疫組化法檢測到的P53蛋白都是這種突變型產(chǎn)物。突變或野生型P53基因，由作為一種轉(zhuǎn)錄因子或成形其他蛋白質(zhì)復(fù)合物在細(xì)胞生長，分化和凋亡中起著重要作用，此外，P53基因失去功能與細(xì)胞分化低，預(yù)后差相關(guān)。本實驗研究中，P53在肝癌組織中有較高的陽性表達(dá)，證實了HCC組織中P53蛋白過表達(dá)是肯定的，P53可作為反應(yīng)HCC生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。P53在癌旁肝硬化組織中有少量表達(dá)，可能與癌旁肝硬化的細(xì)胞常是增殖活躍的細(xì)胞有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。由本實驗可知P53的表達(dá)隨著腫瘤分化程度的降低及門靜脈癌栓的形成而增高;與國內(nèi)多數(shù)學(xué)者的結(jié)論相符［2］，表明P53蛋白參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，與腫瘤的不良生物學(xué)行為有關(guān)。而P53表達(dá)率與年齡、性別及腫瘤大小無明顯相關(guān)(P＞0.05)。P53蛋白表達(dá)情況在一定程度上反映了肝癌細(xì)胞的增殖及惡性程度，已被研究證實在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，因此，一個野生型P53基因的恢復(fù)是一個吸引人的抗癌治療策略［3］。

P63基因是新近發(fā)現(xiàn)的P53的同源基因，屬P53家族的成員之一，由于在結(jié)構(gòu)上具有相同區(qū)域，能激活P53的相關(guān)靶基因，引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的停滯，認(rèn)為與P53一樣是候選的抑癌基因。深入研究發(fā)現(xiàn)P63具有獨特的SAM區(qū)，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖方面有重要的作用。P63基因并不是像P53基因那樣發(fā)生廣泛的突變，而去除P63基因的小鼠也并不像去除P53基因的小鼠那樣表現(xiàn)出腫瘤易感性，這些提示它并不是一個經(jīng)典的抑癌基因［4］。P63基因在人多種腫瘤中的分析表明，P63更為普遍的表現(xiàn)為表達(dá)的異常，不是基因突變［5］。本實驗中原發(fā)性HCC的腫瘤細(xì)胞，是增生活躍、具備很強(qiáng)的增殖能力，因此P63在原發(fā)性HCC中見高表達(dá)，且明顯高于肝硬化組織和正常肝組織，說明P63在HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因的作用，與原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實驗研究中，P63表達(dá)增高與HCC的腫瘤分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明P63的作用在肝癌形成的早期，起促癌作用。P63的陽性表達(dá)率與年齡、性別、腫瘤大小及有無門脈癌栓浸潤無明顯相關(guān)(P＞0.05)。研究表明P63基因與上皮源性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系較為密切，在人的惡性腫瘤尤其是鱗癌中，P63呈擴(kuò)增趨勢［6，7］，國內(nèi)外對上皮源性腫瘤中P63的過表達(dá)研究較多，這與P63編碼的活性產(chǎn)物，主要調(diào)節(jié)胚胎形成時期外胚層分化有關(guān)。在消化系腫瘤中P63也呈過表達(dá)［8］，P63基因轉(zhuǎn)錄、剪切后產(chǎn)生多種異構(gòu)體，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，抑制衰老等功能，與消化系腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

總之，對肝癌的分子生物學(xué)研究應(yīng)該引起我們的重視，希望在肝癌基因類標(biāo)志物研究的同時，更應(yīng)推進(jìn)肝癌蛋白類標(biāo)志物的研究，進(jìn)而提高肝癌的早期診治水平，并作為診斷、預(yù)后判斷和評價腫瘤生物學(xué)行為的客觀指標(biāo)，對指導(dǎo)臨床采用基因治療提供依據(jù)。

1 官成濃，廖湘暉，羅海清，等.P53基因與原發(fā)性肝癌臨床特征的關(guān)系.臨床腫瘤學(xué)雜志，2010，15:974-977.

2 官泳松，拉孜，賀慶，等.血清P53抗體、P53基因表達(dá)與原發(fā)性肝癌的分化程度.第二界中日腫瘤介入治療學(xué)術(shù)會議論文集.2008.

3 Weng SY，Yang CY，Li CC，et al.Synergism between p53 and Mcl-1 in protecting from hepatic injury，fibrosis and cancer.J Hepatol，2011，54:685-694.

4 Osada M，Ohba M，Kawabara C，et al.Cloning and functional analysis of human P51，which structurally and functionally resembles P53.Nat Med，1998，4:839-843.

5 Nishi H，Isaka K，Sagawa Y，et al.Mutation and transcriptionanalysis of the p63 gene in cervical carcinoma.Int J Oncol，1999，15:1149-1153.

6 Yao JY，Pao CC，Chen JK.Transcriptional activity of TAp63 promoter is regulated by c-jun.J Cell Physiol，2010，225:898-904.

7 Shalom-Feuerstein R，Lena AM，Zhou H，et al.ΔNp63 is an ectodermal gatekeeper of epidermal morphogenesis.Cell Death Differ，2011，18:887-96.

8 錢海龍，賀夫林.P53和P63在胰腺腫瘤中的表達(dá)及意義.臨床醫(yī)學(xué)雜志，2006，26:81-84.