馬一杰，陳小兵，羅素霞

河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州 450008

miRNA指紋圖譜及其在結直腸癌個體化治療中的應用

馬一杰，陳小兵，羅素霞

河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州 450008

目的結直腸癌為常見的消化道惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康。由于個體差異的存在，對不同個體采用相同的治療方案不僅造成醫(yī)療資源的浪費，而且可能給患者帶來傷害。近年來，療效和個體差異的關系越來越受到醫(yī)學工作者的重視，個體化治療成為臨床治療及基礎研究必然趨勢。分子生物學及其技術在疾病的診斷及個體化治療方面的重要性日益顯現(xiàn)。microRNAs(miRNAs)是一類非編碼小分子RNA，其表達譜的變化與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展具有明確的相關性。因此，特定miRNA表達譜可能構成識別結直腸癌與其他疾病的"指紋"，用于診斷、預后判斷、療效預測等領域，指導結直腸癌診斷及個體化治療。

miRNA;結直腸癌;個體化治療

大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著醫(yī)學水平的不斷提高，結直腸癌早期診斷和治療手段不斷創(chuàng)新。然而，臨床工作中發(fā)現(xiàn)，即使相同病理類型、分期及接受相同治療方案的不同患者，其療效及不良反應仍具有很大的差異，這種差異有時甚至是致命的。因此，個體化治療是現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展方向和必然趨勢。miRNA作為新的切入點，為結直腸癌個體化治療開辟了新的途徑。

1 miRNA指紋圖譜技術進展

近年來，miRNA成為研究熱點，其光芒蓋過siRNA、mRNA，成為分子生物學領域閃耀的明星。它廣泛參與細胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡等各個進程，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。有趣的是，miRNA“戲路頗廣”，有時扮演正面人物-腫瘤抑制基因，有時也會飾演大反派-癌基因。對于如此極具潛力的標志物候選者，研究者當然不會視而不見。由于對miRNA表達譜的分析是臨床應用的基石，其檢測技術手段在生命科學工作者的努力下也是日新月異，不斷提高創(chuàng)新。

1.1 Northern雜交 首當其沖的，Northern雜交是一種簡便可靠的檢測方法［1］。它不僅能夠用于組織細胞中 miRNA表達水平的檢測，而且可以通過結合RNA marker，經(jīng)凝膠電泳檢測其分子大小。但是，Northern雜交的缺點在于可能出現(xiàn)假陰性，對樣品的需求量相對較高，有時甚至要達到40 μg的樣品量才能出現(xiàn)明顯雜交信號。

1.2 原位雜交 原位雜交是指以特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行，能夠更直觀的展示出miRNA的時空表達模式。此外，該技術不但能夠定量分析單個細胞中miRNA的表達，還能夠在未經(jīng)分類及分離的情況下，比較miRNA在不同細胞株中的表達水平。

1.3 基因芯片 高通量檢驗測定miRNA的平臺當屬基因芯片，它能同時勘測成百上千個 miRNA的表達［2］。芯片應用大規(guī)模微陣列技術，將數(shù)千探針整合于一張芯片，篩選速度和通量得到了很大提高，成為廣大研究者的首選方案。該技術在眾多研究中被采用，藉此建立了不同物種組織miRNA表達譜，同時也被廣泛應用于病變組織和正常組織miRNA表達譜差異鑒定。

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)RT-PCR是一種半定量或定量檢測miRNA表達的實驗技術，在miRNA表達的研究過程中得到不斷改進。該技術的優(yōu)勢在于:可在短時間內(nèi)高通量檢測多種miRNA表達;較之 Northern雜交不需要放射性同位素標記，且RNA需求量較小;能夠同時對成熟miRNA及前體miRNA進行檢測;操作簡便。

2 miRNA指紋圖譜與結直腸癌個體化治療

2.1 miRNA指紋圖譜在結直腸癌靶向治療中的應用

miRNA通過參與調(diào)控一些細胞生命活動關鍵信號通路相關蛋白，如 Wnt/β 粘連蛋白［3］及 PI3K 通路［4］、KRAS［5-6］、p53［7-8］、IGF 信號通路［9］、E2F 家族［10］、細胞外基質(zhì)調(diào)控因子以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)轉(zhuǎn)錄因子等［11-12］，組成強大的基因網(wǎng)絡，它們極有潛力成為結直腸癌治療靶點和強大的干預工具。

相關研究顯示，抑制miR-21和miR-17-92活性能夠減少腫瘤生長、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移［13-14］。這些miRNA在結直腸癌中充當癌基因或抑癌基因，且可能成為miRNA靶向治療候選分子。靶向這些miRNA不僅能夠阻止UICCⅡ期高危疾病的復發(fā)，還可以控制進展期轉(zhuǎn)移性腫瘤的生長。調(diào)控抑癌或促癌基因的基因治療可以用來治療結直腸癌并阻斷損害的進展。這種調(diào)控能控制腫瘤生長率且極有潛力成為早期或進展期腫瘤嶄新的治療手段［15-16］。但是，它們也可能誘導放化療耐藥的發(fā)生。盡管試驗性miRNA治療看起來很有前景，但是只有數(shù)量有限的研究進行了動物模型的體內(nèi)試驗。未來第一個臨床miRNA靶向療法的開發(fā)任重而道遠。

2.2 miRNA指紋圖譜技術在結直腸癌化療中的應用

個體化治療的另一個關鍵部分在于化療療效預測。Nakajima等［17］對接受S-1(基于5-FU的抗代謝藥物)治療的結直腸癌患者腫瘤組織中5種成熟miRNA進行評估，發(fā)現(xiàn)let-7g和miR-181b可作為S-1為基礎的化療應答預測因子。Borralho等［18］以結腸癌細胞株HCT116為模型，探討miR-143對在化療敏感性方面的生物學作用。研究顯示，一過性miR-143過表達可導致約60%的細胞減少。此外，該研究小組用G418篩選穩(wěn)定過表達miR-143的細胞并用5-FU進行處理，結果顯示，穩(wěn)定過表達miR-143的細胞經(jīng)5-FU處理后活性下降且凋亡增加，且這些變化均伴隨核碎裂的增加和 caspase-3，-8，-9 激活。Boni等［19］在61 例接受5-FU和伊立替康(CPT-11)治療的轉(zhuǎn)移性結直腸癌患者中，對18種miRNA基因所在區(qū)域 (原始miRNA和miRNA前體)及miRNA合成相關基因的多態(tài)性與臨床特征的關系進行研究。結果顯示，pri-miR-26a-1 SNP rs7372209與腫瘤應答和疾病進展時間 (TTP)相關(P值分別為0.041和 0.017)?；蛐虲C、CT較TT相比具有更好的預后。SNP rs1834306，位于pri-miR-100基因上，顯示出較長的TTP(P=0.04)。在miRNA的生物合成途徑方面，輸出蛋白-5基因 SNP rs11077與疾病控制率之間具有相關趨勢(P=0.076)。

2.3 miRNA指紋圖譜在結直腸癌預后評估中應用

既有證據(jù)顯示miRNA表達模式對已確診的腫瘤是獨一無二的，且極具潛力成為臨床預后因子。Chen等［20］發(fā)現(xiàn)結直腸癌組織miR-148a和miR-152表達水平與配對癌旁組織相比顯著降低(P＜0.001)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-152、miR-148a的表達水平與腫瘤大小(P值分別為0.004和0.018)及病理T分期 (P值分別為0.002和0.023)負相關。

MiR-21在包括結直腸癌在內(nèi)的很多實體瘤中表達上調(diào)，且其過表達與已知預后因子如N分期，疾病轉(zhuǎn)移和UICC 分期等密切相關［21］。Kulda 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，miR-21和miR-143表達水平與無病生存期(DFI)相關(P值分別為0.0026和0.0191)。MiR-21高表達的患者DFI較短。令人驚訝的是，腫瘤抑制基因miR-143高表達者也表現(xiàn)出較短的DFI。通過對比分析，Schetter等［23］發(fā)現(xiàn)37種不同miRNA在結直腸癌患者腫瘤組織中異常表達。其中，miR-20a，miR-21，miR-106a，miR-181b，和miR-203在COX回歸分析中顯示出較差的生存。該研究組在驗證試驗中用RT-PCR法檢測腫瘤及配對非腫瘤組織中miRNA表達情況，結果顯示，只有miR-21過表達與較差的預后顯著相關，而與年齡、性別和腫瘤位置無關。多元分析進一步顯示腫瘤中miR-21高表達與較差的生存有關，且獨立于腫瘤分期之外。Schepeler等［24］發(fā)現(xiàn)miRNA和Ⅱ期結腸癌微衛(wèi)星穩(wěn)定性有關，基于miRNA表達譜的標記物預測疾病復發(fā)的總體準確度高達81%，因此，miRNA在判斷腫瘤侵襲能力方面極具應用潛力。Kaplan-Meier生存曲線顯示，高表達miR-320或miR-498的Ⅱ期結直腸癌患者無進展生存期(PFS)與低表達患者相比顯著縮短。這些miRNA與PFS的關系也在多元分析中得到驗證。

3 展望

檢測技術日新月異的同時，仍然存在一定的局限性。因此，我們需要綜合運用現(xiàn)有技術手段的同時加快miRNA表達譜研究技術的開發(fā)和改進，進一步提高其敏感性、特異性、穩(wěn)定性以及可重復性。

miRNA指紋圖譜為結直腸癌臨床個體化治療提供新思路，如何結合臨床需求利用miRNA指紋圖譜技術指導臨床決策具有探索性。相信在不久的將來，隨著分子生物學研究的深入和試驗技術的完善，miRNA必將在結直腸癌的發(fā)病機制研究和個體化治療中發(fā)揮更大的作用，帶來未來臨床醫(yī)學上的變革。

［1］ Sempere LF，F(xiàn)reemantle S，Pitha-Rowe I，et al.Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset of brain-expressed microRNAs with possible roles in murine and human neuronal differentiation［J］.Genome Biol，2004，5(3):R13.

［2］ Krichevsky AM，King KS，Donahue CP，et al.A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development［J］.RNA，2003，9(10):1274-1281.

［3］ Nagel R，le Sage C，Diosdado B，et al.Regulation of the adenomatous polyposis coli gene by the miR-135 family in colorectal cancer［J］.Cancer Res，2008，68(14):5795-5802.

［4］ Guo C，Sah JF，Beard L，et al.The noncoding RNA，miR-126，suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers［J］.Genes Chromosomes Cancer，2008，47(11):939-946.

［5］ Webster RJ，Giles KM，Price KJ.Regulation of epidermal growth factor receptor signaling in human cancer cells by microRNA-7 ［J］.J Biol Chem，2009，284(9):5731-5741.

［6］Tsang WP，Kwok TT.The miR-18a*microRNA functions as a potential tumor suppressor by targeting on K-Ras［J］.Carcinogenesis，2009，30(6):953-959.

［7］ Hermeking H.p53 enters the microRNA world［J］.Cancer Cell，2007，12(5):414-418.

［8］ Yamakuchi M，F(xiàn)erlito M，Lowenstein CJ.MiR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(36):13421-13426.

［9］ La Rocca G，Badin M，Shi B，et al.Mechanism of growth inhibition by microRNA 145:the role of the IGF-I receptor signaling pathway［J］.J Cell Physiol，2009，220(2):485-491.

［10］ Woods K，Thomson JM，Hammond SM.Direct regulation of an oncogenic micro-RNA cluster by E2F transcription factors［J］.J Biol Chem，2007，282(4):2130-2134.

［11］ Fearon ER，Vogelstein B.A genetic model for colorectal tumorigenesis［J］.Cell，1990，61(5):759-767.

［12］ Hu G，Chen D，Li XM，et al.MiR-133b regulates the MET proto-oncogene and inhibits the growth of colorectal cancer cells in vitro and in vivo［J］.Cancer Biol Ther，2010，10(2):190-197.

［13］ Krichevsky AM，Gabriely G.MiR-21:a small multi-faceted RNA［J］.J Cell Mol Med，2009，13(1):39-53.

［14］ Dews M，Homayouni A，Yu D，et al.Augmentation of tumor angiogenesis by a Myc-activated microRNA cluster［J］.Nat Genet，2006，38(9):1060-1065.

［15］ Calin GA，Croce CM.Chromosomal rearrangements and microRNAs:a new cancer link with clinical implications［J］.J Clin Invest，2007，117(8):2059-2066.

［16］ Tong AW，Nemunaitis J.Modulation of miRNA activity in human cancer:a new paradigm for cancer gene therapy?［J］.Cancer Gene T-her，2008，15(6):341-355.

［17］ Nakajima G，Hayashi K，Xi Y，et al.Non-coding MicroRNAs hsalet-7g and hsa-miR-181b are Associated with Chemoresponse to S-1 in Colon Cancer［J］.Cancer Genomics Proteomics，2006，3(5):317-324.

［18］ Borralho PM，Kren BT，Castro RE，et al.MicroRNA-143 reduces viability and increases sensitivity to 5-fluorouracil in HCT116 human colorectal cancer cells［J］.FEBS J，2009，276(22):6689-6700.

［19］ Boni V，Zarate R，Villa JC，et al.Role of primary miRNA polymorphic variants in metastatic colon cancer patients treated with 5-fluorouracil and irinotecan［J］.Pharmacogenomics J，2011，11(6):429-436.

［20］ Chen Y，Song Y，Wang Z，et al.Altered expression of MiR-148a and MiR-152 in gastrointestinal cancers and its clinical significance［J］.J Gastrointest Surg，2010，14(7):1170-1179.

［21］ Slaby O，Svoboda M，F(xiàn)abian P，et al.Altered expression of miR-21，miR-31，miR-143 and miR-145 is related to clinicopathologic features of colorectal cancer［J］.Oncology，2007，72(5-6):397-402.

［22］ Kulda V，Pesta M，Topolcan O，et al.Relevance of miR-21 and miR-143 expression in tissue samples of colorectal carcinoma and its liver metastases［J］.Cancer Genet Cytogenet，2010，200(2):154-160.

［23］ Schetter AJ，Leung SY，Sohn JJ，et al.MicroRNA expression profiles associated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma［J］.JAMA，2008，299(4):425-436.

［24］ Schepeler T，Reinert JT，Ostenfeld MS，et al.Diagnostic and prognostic microRNAs in stage II colon cancer［J］.Cancer Res，2008，68(15):6416-6424.

MicroRNA fingerprint in colorectal cancer and its application in individual therapy

MA Yijie，CHEN Xiaobing，LUO Suxia
Department of Oncology，Henan Cancer Hospital，Zhengzhou 450008，China

Colorectal cancer is one of the most frequent malignant disease，it is still a very severe disease for people.Due to individual differences，the same treatment plan for different people would waste medical resources and even harm patients.The efficacy of the oncological treatment depends mainly on the features of the malignant tissue.During the last decade，the importance of the molecular biology and it’s methodology have been growing for both detection of the disease and the selection of the best treatment plan for individual patient.MicroRNAs(miRNAs)are short non-coding segments of RNA which are involved in colorectal cancer development.Thus，“fingerprint”consisted of miRNA expression patterns may contribute individual therapy by refine diagnosis，prognosis and therapeutic effect prediction.

miRNA;Colorectal cancer;Individual therapy

R735.3+4

A

1006－5709(2012)11－0994－03

2012-05-04

10.3969/j.issn.1006-5709.2012.11.004

馬一杰，碩士。E-mail:mayijie1987@126.com

陳小兵，E-mail:chenxiaobing@medmail.com.cn;羅素霞，E-mail:luosxrm@163.com

約稿·專題