王蕊 王一

生物醫(yī)學人工合成的有機化學組織黏合劑在眼科的應用研究已有40多年的歷史，因其使用方便、快捷、安全、廉價，已被用于角膜潰瘍、穿孔的治療和白內障手術角膜切口的封閉［1-2］。黏合劑可以產生足夠的黏合力封閉角膜穿通傷口，但由于眼組織結構精細復雜，生理功能特殊，理化因素的刺激可能引起眼部炎癥反應和組織破壞，導致視功能的損傷。因此有必要對黏合劑黏合角膜穿通傷口眼前節(jié)的病理學改變及對眼前節(jié)的刺激性進行研究。本研究采用α-氰基丙烯酸正辛酯與正丁酯混合醫(yī)用組織黏合劑封閉長約5 mm角膜穿通傷口，并與10-0尼龍縫線縫合方法比較，評價醫(yī)用組織黏合劑治療角膜穿通傷對眼前節(jié)及角膜內皮細胞和血-房水屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 6月齡普通級日本大耳白兔20只，體質量2.0～2.8 kg(平均2.43 kg)，雌雄不拘(第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)。醫(yī)用膠由北京福愛樂科技發(fā)展有限公司提供，為福愛樂醫(yī)用膠。

1.2 分組及手術步驟 20只大耳白兔左眼為縫線組，右眼為醫(yī)用膠組。隨機分為7 d、14 d、30 d、90 d組，每組5只，單籠喂養(yǎng)。30 g·L－1戊巴比妥鈉行兔耳緣靜脈麻醉(30 mg·kg－1)，實驗兔側臥于手術臺，固定四肢，剪除雙眼睫毛，氯霉素滴眼液沖洗結膜囊，鹽酸奧布卡因眼液滴一滴于結膜囊內。常規(guī)消毒鋪巾，開瞼器撐開眼瞼，刮除角膜中央直徑約6 mm表面上皮，于角膜中央區(qū)(1∶00～7∶00鐘位)做一長約5 mm全層切口，整齊對合傷口斷端，右眼醫(yī)用膠(1滴)涂于傷口表面，左眼10-0尼龍縫線縫合傷口3針，檢查傷口無滲漏后，金霉素眼膏涂于結膜囊。術后實驗兔觀察至蘇醒，放回動物房飼養(yǎng)。于術后7 d、14 d、30 d、90 d大體、角膜內皮細胞共聚焦顯微鏡觀察及房水蛋白含量測定后，按照科學實驗動物的道德條例靜脈注射空氣處死動物。取眼球行角膜內皮細胞電鏡觀察。

1.3 大體觀察 術后于各時間觀察點，裂隙燈下觀察兔眼前節(jié)，20 g·L－1熒光素鈉染色觀察角膜傷口愈合過程及密閉性、醫(yī)用膠的降解和前房情況。

1.4 角膜內皮細胞共聚焦顯微鏡觀察 3只實驗兔于術后7 d、14 d、30 d，在全麻下用角膜共聚焦顯微鏡觀察角膜傷口周邊內皮細胞形態(tài)，并于每只眼球角膜傷口中央到兩側角膜緣終點的位置拍攝3張角膜內皮細胞照片，采用Image-Pro plus5.0圖像處理軟件，計算角膜內皮細胞密度。

1.5 房水蛋白含量測定 術后7 d、30 d、90 d，每個實驗點5只實驗兔在全麻下用1 mL注射器從顳上側角鞏膜緣內1 mm透明角膜處刺入前房，分別抽取左、右眼房水0.1 mL，分別置于EP管中－20℃冰箱冷存，待標本收集后行鄰苯三酚紅鉬絡合法(PRM)檢測房水蛋白含量。

1.6 角膜內皮細胞電鏡觀察 術后14 d和30 d分別取醫(yī)用膠組、縫線組兔各1只，迅速摘出眼球，分離角膜，于顯微鏡下取角膜傷口中央兩側1 mm處平行于傷口的1 mm×2 mm大小組織塊，置于4℃、25 g·L－1戊二醛中固定24 h以上，體積分數(shù)1%鋨酸固定2 h，4℃下進行;經脫水、置換、包埋、定位，超薄切片機制作50～60 nm超薄切片，飽和醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色。PHILPS-CM10型透射電鏡觀察角膜內皮細胞及細胞器情況并照相。

2 結果

2.1 角膜傷口大體觀察 術后7 d、14 d、30 d、90 d，醫(yī)用膠組和縫合組角膜傷口均密閉。裂隙燈檢查未見水樣液體從穿通傷口流出，前房深度未見異常。醫(yī)用膠塊于術后14 d邊緣部分脫落，術后90 d完全脫落。醫(yī)用膠組和縫線組術后角膜傷口愈合過程中均未見前房炎癥反應及虹膜、晶狀體的異常改變。

2.2 角膜內皮細胞共聚焦顯微鏡檢查 共聚焦顯微鏡下，內皮細胞邊緣呈黑色，細胞體發(fā)亮，多數(shù)內皮細胞形態(tài)呈六邊形，但術后7 d和14 d醫(yī)用膠組和縫線組均可見部分內皮細胞大小不一，密度無明顯變化(圖1-圖2)。術后30 d隨著傷口的愈合，內皮細胞大小均勻，細胞密度亦無顯著變化。2組術后7 d、14 d、30 d角膜內皮細胞計數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P＞0.05，見表1)。

Figure 1 Corneal endothelial cells in Cyanoacrylate group at 7 days after operation(×400) 醫(yī)用膠組術后7 d角膜內皮細胞(× 400)

Figure 2 Corneal endothelial cells in suturing group at 7 days after operation(×400) 縫線組術后7 d角膜內皮細胞(×400)

表1 術后7 d、14 d、30 d角膜內皮細胞密度比較Table 1 Comparison of corneal endothelial cells density at 7 days，14 days and 30 days after operation between two groups (n=3，s，cell·mm－2)

表1 術后7 d、14 d、30 d角膜內皮細胞密度比較Table 1 Comparison of corneal endothelial cells density at 7 days，14 days and 30 days after operation between two groups (n=3，s，cell·mm－2)

Note:Compared with CA group，△P＞0.05

Group 7 days 14 days 30 days CA 2567.33±193.37 2534.00±60.02 2480.67±67.24 Suture 2484.67±318.85△ 2570.00±364.90△ 2479.33±136.44△

2.3 蛋白含量測定結果 房水蛋白濃度在術后7 d最高，隨角膜傷口愈合逐漸降低，術后90 d恢復正常，各觀察時間點組間差異均無統(tǒng)計學意義(均為P＞0.05，見表2)。

2.4 角膜內皮細胞電鏡觀察 術后14 d，醫(yī)用膠組和縫線組均可見角膜基質層膠原排列較整齊，可見成纖維母細胞，內彈力層均勻。醫(yī)用膠組角膜內皮細胞膜完整，細胞核膜連續(xù)，染色深，核膜下異染色質增多，但分布均勻?？p線組細胞漿內少量線粒體腫脹，基質疏松，內嵴間隙增寬，可見小空泡樣變。僅有少量粗面內質網擴張(圖3-圖4)。術后30 d，醫(yī)用膠組和縫線組均可見角膜基質層膠原排列整齊，可見角膜內皮細胞，內彈力層均勻。角膜內皮細胞形態(tài)規(guī)則，胞膜連續(xù)，細胞核結構完整，呈梭形，異染色質在核膜下聚集，細胞器基本正常，粗面內質網擴張不明顯，細胞漿內線粒體未見明顯異常。

表2 術后7 d、30 d、90 d房水蛋白檢測結果比較Table 2 Comparison of protein content of aqueous humor in aqueous humor at 7 days，30 days and 90 days after operation between two groups (n=5，s，ρ/g·L－1)

表2 術后7 d、30 d、90 d房水蛋白檢測結果比較Table 2 Comparison of protein content of aqueous humor in aqueous humor at 7 days，30 days and 90 days after operation between two groups (n=5，s，ρ/g·L－1)

Note:Compared with CA group，△P＞0.05

Group 7 days 30 days 90 days CA 0.561±0.284 0.421±0.139 0.317±0.062 Suture 0.523±0.303△ 0.472±0.058△ 0.398±0.091△

Figure 3 Transmission electron microscope image of cyanoacrylate group at 14 days after operation(×17 000) 醫(yī)用膠組術后14 d角膜內皮細胞電鏡觀察結果(×17 000)

Figure 4 Transmission electron microscope image of suturing group at 14 days after operation(×24 000) 縫線組術后14 d角膜內皮細胞電鏡觀察結果(×24 000)

3 討論

3.1 醫(yī)用組織黏合劑(α-氰基丙烯酸酯)的理化性質和組織相容性 α-氰基丙烯酸酯類組織黏合劑(CA)早在19世紀40年代就被研究用于醫(yī)學領域。19世紀60年代首次應用于眼科［3］。透明、無色、液體狀態(tài)下的單體黏合劑在應用于生物組織時迅速發(fā)生單體放熱聚合反應，發(fā)揮其黏接作用。α-氰基丙烯酸酯類組織黏合劑的組織刺激反應主要由其發(fā)生聚合反應時所釋放的聚合熱引起，與其烴基鏈的大小有關［4］。早期的短烴基鏈α-氰基丙烯酸酯(α-氰基丙烯酸甲酯等)由于毒性大，組織相容性差，限制了其在眼科的應用。長烴基鏈α-氰基丙烯酸酯類黏合劑是惰性的，比絲線和腸線引起的反應要小得多［5］。α-氰基丙烯酸正辛酯是具有8個碳原子的烴基鏈，降解速度慢，聚合熱低，擴散性好，聚合體表面較光滑，韌性好，具有更好的組織相容性和物理性能［6］。近幾年長烴基鏈α-氰基丙烯酸酯(α-氰基丙烯酸正辛酯、α-氰基丙烯酸正丁酯等)已用于眼科研究，如角膜和鞏膜穿孔的治療、結膜傷口治療、視網膜脫離的治療、瞼成形術、義眼臺植入術，均取得了較好的療效［7-11］。

本實驗使用的是以α-氰基丙烯酸正辛酯為主體的復合醫(yī)用膠，具有無致癌、致畸、致突變、并對11種細菌形成抑菌帶等優(yōu)點［12-13］，并具有聚合速度相對延長、白化現(xiàn)象輕等特點，更利于手術操作和術后觀察。本研究中的α-氰基丙烯酸正辛酯和正丁酯復合膠及其降解物對眼前節(jié)局部刺激反應與縫線組比較無明顯差別。

3.2 醫(yī)用組織黏合劑應用于眼表的組織反應

3.2.1 黏合劑對角膜內皮細胞的影響 角膜內皮細胞是維持角膜正常形態(tài)和生理功能的基礎，黏合劑是否引起角膜內皮細胞的病理變化是評價黏合劑對角膜組織影響的重要指標之一。角膜內皮損傷后，周邊的角膜內皮細胞向受損區(qū)移行，14 d可完成修復過程。共聚焦顯微鏡檢查顯示:醫(yī)用膠組和縫線組角膜內皮細胞的形態(tài)無明顯變化，兩組術后不同時間點角膜內皮細胞密度差異均無統(tǒng)計學意義(均為P＞0.05)。角膜內皮細胞電鏡觀察結果表明，黏合劑不引起內皮細胞組織病理和超微結構改變。Ollivier等［14］將黏合劑涂抹于伴基質缺損的角膜表面，研究兔眼角膜對α-氰基丙烯酸正丁酯耐受的實驗中，術后20 d大體和組織學觀察示無明顯炎癥反應。

3.2.2 黏合劑對血-房水屏障的影響 房水蛋白含量是評價血-房水屏障功能的一項重要指標，能客觀反映前房有無炎癥反應。前房的炎癥、虹膜睫狀體炎、眼外傷或內眼手術后，由于血-房水屏障遭到破壞，使屏障通透性增強，房水蛋白含量可明顯增加［15］。本實驗中醫(yī)用膠組和縫線組術后7 d房水蛋白含量高于術后90 d，是角膜外傷引起的，而不是黏合劑引起的。醫(yī)用膠組和縫線組房水蛋白含量在術后各觀察點比較差異均無統(tǒng)計學意義(均為P＞0.05)。結果表明，醫(yī)用膠不引起房水蛋白增加，不引起前房炎癥反應。

綜上所述，醫(yī)用組織黏合劑用于黏合角膜穿通傷口，具有良好的生物組織相容性，不引起角膜組織病理學改變和血-房水屏障的破壞。本研究為醫(yī)用組織黏合劑用于臨床治療奠定了一定的理論基礎。

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