朱子誠(chéng) 柯根杰 溫躍春 顧起宏 孫 冰

AG490(tyrphostin AG490)即a-氰基-(3，4-羥基) N-芐苯乙烯胺，是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈的脂類(lèi)衍生物，結(jié)構(gòu)類(lèi)似酪氨酸，是JAK2激酶抑制劑，可以特異性阻斷 Stat3信號(hào)通路［1］。目前，AG490作為抗腫瘤藥物已用于臨床治療，其毒副作用很?。?-3］，顯示出很好的應(yīng)用前景。我們的前期研究認(rèn)為［4］，AG490作為阻斷劑可能對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1誘導(dǎo)豚鼠鞏膜成纖維細(xì)胞(guinea pig scleral fibroblast，GSF)Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活起調(diào)控作用，但AG490對(duì)正常生理狀態(tài)下細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)有無(wú)影響尚不清楚，為此，本文擬采用不同濃度的AG490研究其對(duì)體外培養(yǎng)的GSF生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，為其在眼科領(lǐng)域的臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GSF的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng) 取出生3 d內(nèi)的豚鼠后部鞏膜組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊接種于25 cm2培養(yǎng)瓶壁上，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用2.5 g·L－1胰蛋白酶消化，傳代。細(xì)胞鑒定:取2－3代細(xì)胞制備細(xì)胞鋪片檢測(cè)波形蛋白的表達(dá)。

1.2 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞生存活力 傳3代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GSF經(jīng)不同濃度(0 μmol·L－1、15 μmol·L－1、25 μmol·L－1、50 μmol·L－1、75 μmol· L－1)AG490處理48 h后，制成單細(xì)胞懸液，取9滴細(xì)胞懸液移入小試管中，加1滴4 g·L－1臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻，在3 min內(nèi)用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)，不加AG490(即0 μmol·L－1AG490)的細(xì)胞作對(duì)照組。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)測(cè)定細(xì)胞增殖能力 取3－4代培養(yǎng)的GSF，按100×106L－1接種于96孔板，每孔加100 μL。細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，用無(wú)血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h以同步化。分別加入終濃度為15 μmol·L－1、25 μmol·L－1、50 μmol·L－1、75 μmol·L－1的AG490，空白對(duì)照組只加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。加藥培養(yǎng)48 h后，棄上清液，每孔加入5 g· L－1MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min后，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于492 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值。

1.4 細(xì)胞周期測(cè)定 取3－4代培養(yǎng)的GSF，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化后，以每瓶300×103個(gè)細(xì)胞接種于50 cm2培養(yǎng)瓶，在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM液中培養(yǎng)24 h后，用無(wú)血清的DMEM洗1次，加入含25 μmol·L－1AG490和含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每瓶溶液量5 mL。對(duì)照組只加入含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)。加藥48 h后終止培養(yǎng)。以2.5 g·L－1胰蛋白酶消化，將消化下來(lái)的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌2次，800 r·min－1離心5 min，棄上清，加入1 mL的磷酸鹽緩沖液將細(xì)胞混勻，再加入2 mL無(wú)水乙醇立即振蕩混勻，封口膜封閉，4℃過(guò)夜。上機(jī)檢測(cè)前離心(800 r·min－1，5 min)，去除乙醇，磷酸鹽緩沖液洗滌，800 r·min－1離心5 min，重復(fù)2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109L－1，各管加入5 g·L－1碘化丙啶(PI染液)，室溫避光染色20 min，流式細(xì)胞儀測(cè)試分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，測(cè)試數(shù)據(jù)用s表示，不同濃度組的細(xì)胞存活率比較采用卡方檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 組織塊接種后5～7 d可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊邊緣長(zhǎng)出。原代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)7～10 d接近長(zhǎng)滿(mǎn)瓶。倒置相差顯微鏡下觀察，剛從組織塊長(zhǎng)出的GSF呈星形，培養(yǎng)數(shù)天及傳代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞透亮呈梭形。在細(xì)胞密度較低時(shí)細(xì)胞排列成網(wǎng)狀，密度較高時(shí)呈束狀。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 波形蛋白染色陽(yáng)性，胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為GSF。

2.3 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)不同濃度的AG490對(duì)GSF存活率的影響 15 μmol·L－1、25 μmol·L－1的AG490對(duì)體外培養(yǎng)的GSF干預(yù)48 h，存活率分別是94.6%和94.1%，與對(duì)照組(95.5%)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.62、9.65，均為P＞0.05)，即使AG490濃度為50 μmol·L－1時(shí)，48 h后GSF存活率仍達(dá)87.1%。

2.4 MTT法檢測(cè)AG490對(duì)GSF增殖能力的影響15 μmol·L－1、25 μmol·L－1的AG490對(duì)體外培養(yǎng)的GSF干預(yù)48 h后，未見(jiàn)促進(jìn)或抑制增殖能力作用，與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.91、3.89，P＞0.05;圖1)。

Figure 1 Dose-effect curve of AG490 on GSF proliferation AG490對(duì)GSF增殖的劑量效應(yīng)圖

2.5 AG490對(duì)GSF細(xì)胞周期的影響 對(duì)照組的G1期細(xì)胞百分比(80.2%)、S期細(xì)胞百分比(9.6%)以及反映細(xì)胞增殖活力的增殖指數(shù)(19.8%)，與實(shí)驗(yàn)組(25 μmol·L－1AG490)的G1期細(xì)胞百分比(82.2%)、S期細(xì)胞百分比(7.5%)以及細(xì)胞增殖指數(shù)(17.9%)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)(圖2-圖3)。

3 討論

Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)能與DNA結(jié)合的胞漿蛋白家族，是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路［5-6］。Stat3蛋白是一種雙功能的信號(hào)分子，不僅能夠把細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，而且能直接參與細(xì)胞的基因調(diào)控。因此，理論上阻斷Stat3信號(hào)途徑任一環(huán)節(jié)，都可以抑制其上游眾多酪氨酸激酶?jìng)鬟f的信號(hào)以及下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而成為防治眾多疾病的理想侯選靶目標(biāo)。目前主要方法包括直接阻斷Stat3的功能和間接阻斷Stat3活化。直接阻斷包括反抑寡核苷酸(與Stat3的mRNA結(jié)合阻斷其翻譯)、誘餌寡核苷酸(與 Stat3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA)、顯性負(fù)性蛋白(突變型蛋白功能超越并抑制了野生型蛋白的功能);間接阻斷指從Stat3信號(hào)通路的不同階段加以阻斷，包括受體拮抗劑、酪氨酸激酶抑制劑、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、磷酸酶調(diào)節(jié)、阻斷Stat3二聚體形成、抑制二聚體核轉(zhuǎn)位等。

Figure 2 Cell cycle picture of GSF before interfered by AG490.Figure 3 Cell cycle picture of GSF after interfered by AG490 圖2 AG490刺激GSF前細(xì)胞周期圖。圖3 AG490刺激GSF后細(xì)胞周期圖

AG490分子式為C17H14N2O3，相對(duì)分子質(zhì)量為294.3，結(jié)構(gòu)類(lèi)似酪氨酸，可以和受體酪氨酸激酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，是JAK2激酶抑制劑，可以特異性阻斷JAK-Stat3信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)首先采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法和MTT法研究了不同濃度的AG490對(duì)體外培養(yǎng)的正常GSF生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，以篩選最佳的濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。結(jié)果顯示在一定濃度范圍(≤25 μmol·L－1)的AG490對(duì)正常GSF的生存率和增殖能力沒(méi)有明顯影響(P＞0.05)。有研究檢測(cè)了不同濃度的AG490(25 μmol·L－1、50 μmol·L－1、75 μmol·L－1)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，25 μmol·L－1濃度的AG490干預(yù)48 h后對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖率無(wú)明顯影響(P＞0.05)，直到濃度達(dá)到50 μmol·L－1時(shí)，AG490才顯示對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖有抑制作用(P＜0.05)［7］。楊爽等［8］研究也顯示用40 μmol·L－1的AG490可以抑制心肌營(yíng)養(yǎng)素-1刺激的心肌細(xì)胞肥大，但不影響心肌營(yíng)養(yǎng)素-1的心肌保護(hù)作用。Huang等［9］采用Western blotting和組織免疫化學(xué)法結(jié)合熒光標(biāo)記法，在體外正常視網(wǎng)膜組織塊和急性高眼壓作用后視網(wǎng)膜組織塊內(nèi)，研究JAK/Stat信號(hào)通路的激活狀況和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)的生存率，以及AG490和JAK抑制劑Ⅰ對(duì)RGC活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常眼視網(wǎng)膜組織塊內(nèi)無(wú)激活的JAK/Stat信號(hào)通路，急性高眼壓則可激活Stat3信號(hào)蛋白磷酸化，抑制JAK/Stat信號(hào)通路，且同樣不會(huì)影響正常視網(wǎng)膜組織塊內(nèi) RGC的生存。最為重要的是，Huang等［9］還進(jìn)一步研究了AG490和JAK抑制劑Ⅰ對(duì)動(dòng)物體內(nèi) JAK/Stat3信號(hào)通路的影響，結(jié)果也顯示AG490可阻斷急性高眼壓引起的JAK/Stat3信號(hào)通路激活介導(dǎo)的RGC生存，而正常視網(wǎng)膜內(nèi)RGC生存不需要JAK/Stat3信號(hào)通路激活介導(dǎo)，因此，AG490等抑制劑也不起作用。進(jìn)一步說(shuō)明AG490對(duì)正常生理情況下的細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。

另外，AG490對(duì)GSF的細(xì)胞周期也沒(méi)有明顯影響。流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期的結(jié)果表明，AG490作用于GSF后，G1期細(xì)胞百分比沒(méi)有明顯降低，而S期細(xì)胞百分比也無(wú)明顯升高，表明AG490不能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1期向G2期和S期轉(zhuǎn)化。增殖指數(shù)代表了該細(xì)胞群體中增殖期細(xì)胞的數(shù)量(S+G2－M)占各期之和(G0/G1+S+G2/M)百分比，其中G2為DNA合成后期，M期為有絲分裂期，它表示細(xì)胞的增殖活性。GSF經(jīng)一定濃度的AG490(25 μmol· L－1)處理后增殖指數(shù)沒(méi)有顯著升高或降低，其可能的原因是AG490沒(méi)有激活靜止態(tài)的G0/G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)變，使DNA合成量增加，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在正常生理情況下，其激活是暫時(shí)的，往往只有數(shù)分鐘或幾小時(shí)，并處于嚴(yán)密調(diào)控之中，只有在長(zhǎng)期的慢性病理情況下或致瘤信號(hào)的刺激下，Stat3才會(huì)被持續(xù)激活，恒定地存在于細(xì)胞核中，調(diào)控目標(biāo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與促進(jìn)細(xì)胞的增長(zhǎng)和抗凋亡作用［10］。另外，由于特定情況下，同一種生長(zhǎng)因子可以通過(guò)不同的信號(hào)途徑調(diào)控同一或多個(gè)靶基因的表達(dá)，不同的信號(hào)通路之間可能具有網(wǎng)絡(luò)性的交互作用和時(shí)相及量效差異，因此，除了正常生理情況下細(xì)胞的增長(zhǎng)很少需要激活Stat3信號(hào)蛋白外，另一個(gè)原因可能是生長(zhǎng)因子等上游激活因子也同時(shí)通過(guò)其他途徑代償缺失的Stat3信號(hào)途徑，使正常細(xì)胞生長(zhǎng)不會(huì)受到影響。而AG490是一種特異性的阻斷JAK2/Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的酪氨酸酶受體抑制劑，因此對(duì)正常生理情況下的細(xì)胞(幾乎沒(méi)有Stat3磷酸化形式存在)不起明顯的毒副作用。

總之，本文研究了不同濃度的 AG490對(duì)正常GSF生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)AG490對(duì)正常GSF的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。AG490促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞增長(zhǎng)和抗凋亡的作用還有待于進(jìn)一步采用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)和手段研究，為臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

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