彭 坤 靳 雋 楊玉新 許銀霞 王保君 閆義濤 楊 華

青光眼治療首選仍是降眼壓藥物，有些患者需要長期甚至終身使用，長期用藥帶來的毒性作用也日益得到關(guān)注。研究表明，長期應(yīng)用抗青光眼藥物能引起眼表組織損傷，如結(jié)膜炎癥、淺層點(diǎn)狀角膜炎、淚液分泌減少、淚膜破裂時(shí)間縮短等，術(shù)前長期抗青光眼藥物治療是濾過性手術(shù)失敗的危險(xiǎn)因素之一。發(fā)生這些改變的機(jī)制主要是藥物和其賦形劑引起的過敏反應(yīng)、毒性作用及慢性炎癥［1］。本研究采用免疫組織化學(xué)方法，觀察噻嗎洛爾單一用藥及聯(lián)合用藥時(shí)不同時(shí)相炎性標(biāo)記物細(xì)胞間黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和人類白細(xì)胞抗原-DR(human leukocyte antigen-DR，HLADR)在結(jié)膜組織中的表達(dá)情況，為明確長期應(yīng)用抗青光眼藥物的毒性作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 TS-12J生物自動(dòng)脫水機(jī)(湖北孝感諾普電子科技有限責(zé)任公司)，Leica SM2400切片機(jī)、Leica Hi展片機(jī)(德國Leica公司)，F(xiàn)A1104電子天平及臺(tái)式高速離心機(jī)(上海升隆電子天平公司)，WD800TL23-K3微波爐(廣州格蘭仕集團(tuán)有限公司)，新飛組合變溫型冰箱BCP-205(河南新飛電器有限公司)，電熱恒溫水溫箱(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)，顯微鏡和直立光照照像系統(tǒng)(日本O-lympus株氏會(huì)社)。兔抗人ICAM-1單克隆抗體、兔抗人HLA-DR單克隆抗體、即用型SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒、TDAB染色試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 研究對(duì)象 從我科收住的患者中隨機(jī)選擇40歲以上原發(fā)性開角型青光眼患者90例，所有患者均無糖尿病、腎病及風(fēng)濕病史，局部及全身未用過糖皮質(zhì)激素，裂隙燈下檢查球結(jié)膜無微血管瘤、角膜緣無新生血管和眼部無炎癥。根據(jù)抗青光眼藥物治療的種類分為3組:應(yīng)用2種青光眼藥物治療(5 g·L-1噻嗎洛爾與2 g·L-1阿法根)即聯(lián)合用藥組30例，1種抗青光眼藥物治療(5 g·L-1噻嗎洛爾)即單一用藥組30例，無抗青光眼藥物治療即未用藥組30例。另選擇單純白內(nèi)障患者30例作為空白對(duì)照組，眼部滿足條件同原發(fā)性開角型青光眼患者。各組按抗青光眼藥物治療時(shí)間及白內(nèi)障患病時(shí)間又分為3個(gè)時(shí)相(0～6個(gè)月、7～12個(gè)月、13～18個(gè)月)組，每組10例。參與實(shí)驗(yàn)的患者已知情并同意，并且通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 標(biāo)本收集 90例青光眼球結(jié)膜標(biāo)本均為小梁切除術(shù)時(shí)在位于角膜緣鼻上方11∶00～1∶00點(diǎn)鐘位、以最小創(chuàng)傷剪除的2 mm×2 mm球結(jié)膜組織，30例白內(nèi)障球結(jié)膜標(biāo)本為晶狀體植入術(shù)時(shí)切除的2 mm×2 mm球結(jié)膜組織，每次切除的球結(jié)膜組織立即放于裝有5 mL福爾馬林、酒精、冰醋酸混合固定液的小瓶中，常溫下固定，固定時(shí)間至少24 h，最多不超過半年，所有標(biāo)本常溫下保存。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 球結(jié)膜組織于體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛中固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，3 μm厚度切片，常規(guī)脫蠟至水。蒸餾水洗2 min×3次，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，室溫30 min，蒸餾水洗2 min×3次。切片置于0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)內(nèi)，微波爐內(nèi)加熱使溫度保持在92～98℃之間并保持10～15 min，室溫冷卻20 min，0.02 mol·L-1PBS洗3 min×3次。滴加50 g·L-1BSA封閉液，37℃ 30 min，甩去多余液體，不洗。兔抗人ICAM-1單克隆抗體(1∶100)、兔抗人HLA-DR單克隆抗體(1∶100)作為一抗，4℃孵育過夜，0.02 mol·L-1PBS洗3 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG作為二抗，37℃ 20 min，0.02 mol·L-1PBS洗3 min×3次。滴加試劑SABC，37℃ 20 min，0.02 mol·L-1PBS洗5 min×4次。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，用PBS代替一抗作空白對(duì)照。光鏡下ICAM-1和HLADR陽性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞膜或細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色。在400倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)不重疊的視野，每張標(biāo)本連續(xù)選擇4張切片，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野下ICAM-1和HLA-DR陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)膜組織中ICAM-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果空白對(duì)照組與未用藥組結(jié)膜組織中ICAM-1陽性細(xì)胞數(shù)各時(shí)相均維持在較低水平，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05，見圖1-圖2)?？骨喙庋鬯幬镒饔?～6個(gè)月、7～12個(gè)月時(shí)，單一用藥組、聯(lián)合用藥組及未用藥組和空白對(duì)照組比較，ICAM-1陽性細(xì)胞均無明顯增多，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為 P＞0.05，見圖3-圖6);抗青光眼藥物作用13～18個(gè)月時(shí)，單一用藥組及聯(lián)合用藥組ICAM-1陽性細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組明顯增多，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01)，且聯(lián)合用藥組增加更明顯。單一用藥組及聯(lián)合用藥組在13～18個(gè)月時(shí)ICAM-1陽性細(xì)胞數(shù)較0～6個(gè)月、7～12個(gè)月明顯增多，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01，見圖7-圖8、表1)。

表1 各組結(jié)膜組織中不同時(shí)相ICAM-1陽性細(xì)胞數(shù)比較Table 1 Comparison of ICAM-1 positive cells in conjunctival tissue at different time points in each group (s，eyes)

Note:Compared with former time point in the same group，*P＜0.01;Compared with control group at the same time，△P＜0.01

Group n 0-6 months 7-12 months 13-18 months Combined therapy 30 6.27±1.39 7.07±1.32 32.61±1.53＊△Single treatment 30 6.21±1.45 6.89±1.31 22.59±1.85＊△Non-drug 30 5.74±0.97 5.43±1.34 5.38±2.31 Control 30 4.98±1.65 5.45±1.73 5.12±1.14

2.2 結(jié)膜組織中HLA-DR免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

空白對(duì)照組與未用藥組結(jié)膜組織中HLA-DR陽性細(xì)胞數(shù)各時(shí)相均維持在較低水平，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05，見圖9-圖10)。單一用藥組與聯(lián)合用藥組在0～6個(gè)月、7～12個(gè)月時(shí)結(jié)膜組織中HLA-DR陽性細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05，見圖11-圖14)，但在13～18個(gè)月時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高，與前兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01);單一用藥組及聯(lián)合用藥組13～18個(gè)月時(shí)HLA-DR陽性細(xì)均胞數(shù)較1～6個(gè)月、7～12個(gè)月明顯增多，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.01，見圖15-圖16、表2)。

Figure 1 Expression of ICAM-1 in control group(×400).Figure 2 Expression of ICAM-1 in non-drug treatment group(×400).Figure 3 Expression of ICAM-1 in single treatment group at 0-6 months(×400).Figure 4 Expression of ICAM-1 in combined treatment group at 0-6 months (×400).Figure 5 Expression of ICAM-1 in single treatment group at 7-12 months(×400).Figure 6 Expression of ICAM-1 in combined treatment group at 7-12 months(×400).Figure 7 Expression of ICAM-1 in single treatment group at 13-18 months(×400).Figure 8 Expression of ICAM-1 in combined treatment group at 13-18 months(×400) 圖1 空白對(duì)照組中ICAM-1的表達(dá)(×400)。圖2 未用藥組中ICAM-1的表達(dá)(×400)。圖3 單一用藥組中0～6個(gè)月時(shí)ICAM-1的表達(dá)(×400)。圖4 聯(lián)合用藥組中0～6個(gè)月時(shí)ICAM-1的表達(dá)(×400)。圖5 單一用藥組中7～12個(gè)月時(shí)ICAM-1的表達(dá)(×400)。圖6 聯(lián)合用藥組中7～12個(gè)月時(shí)ICAM-1的表達(dá)(×400)。圖7 單一用藥組中13～18個(gè)月時(shí)ICAM-1的表達(dá)(×400)。圖8 聯(lián)合用藥組中13～18個(gè)月時(shí)ICAM-1的表達(dá)(×400)

Figure 9 Expression of HLA-DR in control group(×400).Figure 10 Expression of HLA-DR in non-drug treatment group(×400).Figure 11 Expression of HLA-DR in single treatment group at 0-6 months(×400).Figure 12 Expression of HLA-DR in combined treatment group at 0-6 months(×400).Figure 13 Expression of HLA-DR in single treatment group at 7-12 months(×400).Figure 14 Expression of HLA-DR in combined treatment group at 7-12 months(×400).Figure 15 Expression of HLA-DR in single treatment group at 13-18 months(×400).Figure 16 Expression of HLA-DR in combined treatment group at 13-18 months(×400) 圖9 空白對(duì)照組中HLA-DR的表達(dá)(×400)。圖10在未用藥組中HLA-DR的表達(dá)(×400)。圖11 單一用藥組中0～6個(gè)月時(shí)HLA-DR的表達(dá)(×400)。圖12 聯(lián)合用藥組中0～6個(gè)月時(shí)HLADR的表達(dá)(×400)。圖13 單一用藥組中7～12個(gè)月時(shí)HLA-DR的表達(dá)(×400)。圖14 聯(lián)合用藥組中7～12個(gè)月時(shí)HLA-DR的表達(dá)(× 400)。圖15 單一用藥組中13～18個(gè)月時(shí)HLA-DR的表達(dá)(×400)。圖16 聯(lián)合用藥組中13～18個(gè)月時(shí)HLA-DR的表達(dá)(×400)

表2 各組結(jié)膜組織中不同時(shí)相HLA-DR陽性細(xì)胞數(shù)比較Table 2 Comparison of HLA-DR positive cells in conjunctival tissue at different time points in each group (s，eyes)

表2 各組結(jié)膜組織中不同時(shí)相HLA-DR陽性細(xì)胞數(shù)比較Table 2 Comparison of HLA-DR positive cells in conjunctival tissue at different time points in each group (s，eyes)

Note:Compared with former time point in the same group，*P＜0.01;Compared with control group at the same time，△P＜0.01

Group n 0-6 months 7-12 months 13-18 months Combined therapy 30 6.15±1.56 6.78±1.76 31.24±1.90＊△Single treatment 30 6.11±1.64 6.29±1.34 21.80±1.88＊△Non-drug 30 5.75±1.49 5.61±1.08 5.87±1.73 Control 30 5.34±1.47 5.81±1.39 5.66±1.52

3 討論

長期應(yīng)用抗青光眼藥物能誘發(fā)眼部炎癥而引起眼部不適，破壞淚膜穩(wěn)定性，導(dǎo)致角膜表面損傷及抗青光眼手術(shù)失敗。最近的研究證實(shí)抗青光眼藥物中的防腐劑是引起眼部炎癥的主要原因?？骨喙庋鬯幬镏刑砑拥姆栏瘎┯卸喾N，通常有氯化苯甲胺、硫柳汞、尼泊金、洗必泰等，而最常見的防腐劑是氯化苯甲胺［2］，它的毒副作用最大。氯化苯甲胺會(huì)導(dǎo)致結(jié)膜杯狀細(xì)胞減少，引起基礎(chǔ)淚液分泌減少，還能引起球結(jié)膜炎、點(diǎn)狀角膜炎、瞼緣炎、結(jié)膜纖維化和干眼癥。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，長期應(yīng)用含防腐劑的抗青光眼藥物可誘導(dǎo)結(jié)膜組織過度表達(dá)炎癥因子HLA-DR、ICAM-1、Fas-抗原及細(xì)胞凋亡標(biāo)記物Apo2.7。

HLA-DR分子屬于Ⅱ型組織相容性抗原，由位于人類第6號(hào)染色體上的HLAⅡ類基因中的DR亞區(qū)所編碼，通常只表達(dá)于免疫系統(tǒng)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞(抗原遞呈細(xì)胞)、B淋巴細(xì)胞、激活的T淋巴細(xì)胞等，能與外源性的抗原肽結(jié)合，在細(xì)胞表面表達(dá)，參與外源性抗原遞呈途徑。在免疫介導(dǎo)細(xì)胞活性增強(qiáng)和炎癥情況下，如干眼癥、慢性結(jié)膜炎、Sj?gren綜合征等，HLA-DR在結(jié)膜上皮細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，通過介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附，參與多種炎癥反應(yīng)和免疫過程。ICAM-1以較低水平廣泛表達(dá)于全身大多數(shù)組織中。正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞中的ICAM-1表達(dá)很低，外傷、炎癥刺激等能誘導(dǎo)ICAM-1蛋白及mRNA的表達(dá)，增強(qiáng)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮間的黏附作用，從而促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展。在眼部免疫活性增強(qiáng)及眼表相關(guān)性炎癥疾病中，如眼部過敏性疾病、寄生蟲感染、眼部紅斑狼瘡、Sj?gren綜合征等［3-5］，可以檢測到ICAM-1的表達(dá)增強(qiáng)。長期使用含防腐劑的抗青光眼滴眼液［6-7］及配戴角膜接觸鏡［8］引起的結(jié)膜炎癥反應(yīng)中可以檢測到HLA-DR和ICAM-1過度表達(dá)。HLA-DR和ICAM-1這兩種炎性標(biāo)記物和炎性反應(yīng)關(guān)系密切，具有炎性標(biāo)記物代表性。

本研究表明，局部應(yīng)用抗青光眼藥物(單一或聯(lián)合用藥)1 a以下者，結(jié)膜組織中HLA-DR和ICAM-1陽性表達(dá)較少，而應(yīng)用抗青光眼藥物1 a以上者，陽性表達(dá)增多，尤其是聯(lián)合用藥表達(dá)較多。炎性標(biāo)記物表達(dá)增加，進(jìn)一步證實(shí)結(jié)膜組織可能存在炎性反應(yīng)。

Pisella等［6］及Guenoun等［7］應(yīng)用新型抗青光眼前列腺素類滴眼液的臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，拉坦前列素、曲伏前列素及貝美前列素不含防腐劑滴眼液長期應(yīng)用與不含防腐劑噻嗎洛爾滴眼液長期應(yīng)用的結(jié)果與正常眼無明顯差異;含防腐劑前列腺素類滴眼液和含防腐劑噻嗎洛爾滴眼液均引起HLA-DR和ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)，但噻嗎洛爾更加明顯，表明防腐劑是長期應(yīng)用抗青光眼滴眼液引起炎癥的關(guān)鍵因素，前列腺素類藥物具有降低防腐劑毒性作用的功能。

前列腺素類藥物滴眼液具有降壓作用確切、毒副作用少、滴眼頻率低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸在臨床上成為一線降眼壓藥物。國內(nèi)張琛等［9］研究發(fā)現(xiàn)玻璃酸鈉滴眼液通過抗氧化損傷能降低防腐劑的毒性作用，但對(duì)于有些需長期用藥的青光眼患者來說，研發(fā)不含防腐劑的抗青光眼滴眼液仍是當(dāng)前的迫切需要。

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9 張 琛，王志昕，鄧世靖，孫旭光.防腐劑對(duì)兔角結(jié)膜上皮細(xì)胞毒性及玻璃酸鈉保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.眼科新進(jìn)展，2008，28 (2):85-89.