辛志敏 張全樂 孫瑩璞 金海霞 宋文妍

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心(450052)

在人類胚胎培養(yǎng)中，主要提供兩種氣體環(huán)境:一種是5%CO2，其余為空氣(20%O2);另一種5%CO2，5%O2和90%N2(5%O2)的混合氣體。對小鼠、羊和牛等動物研究證實，將空氣中氧氣的濃度降至5% ～7%有利于胚胎發(fā)育［1］。然而 Dumoulin等［2］在人類胚胎培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，低氧培養(yǎng)對于第2天及第3天移植的胚胎妊娠率并無明顯影響，因此有學(xué)者認(rèn)為在人胚胎發(fā)育早期可能對較高濃度O2產(chǎn)生的毒性不敏感，第3天以后的囊胚培養(yǎng)給予5%O2低氧培養(yǎng)較為合理。但Leoni等［3］的研究發(fā)現(xiàn)人卵子在20%O2的高氧條件下授精后，其囊胚的發(fā)育潛能嚴(yán)重破壞，該研究表明在胚胎發(fā)育早期由高濃度O2產(chǎn)生的破壞已經(jīng)存在。本研究對第3天移植胚胎于兩種氣體環(huán)境下培養(yǎng)的發(fā)育潛能進行比較，以期發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境對胚胎早期發(fā)育及妊娠率的影響。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

2009年12月～2010年6月在本中心接受常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)619個周期。不孕原因為輸卵管盆腔因素、免疫因素及原因不明因素，排除嚴(yán)重的男性因素。根據(jù)氣體培養(yǎng)環(huán)境分為兩組:20%O2組，5%O2組。

1.2 方法

1.2.1 臨床方案 兩組對象均采用常規(guī)長方案超排卵，卵泡成熟后肌注人絨毛膜促性腺激素(hCG)，36～38h陰道B超引導(dǎo)下取卵。

1.2.2 卵子受精及胚胎培養(yǎng) 卵子和胚胎培養(yǎng)采用瑞士Vitrolife公司G系列序列培養(yǎng)基，精液處理采用密度梯度離心法。卵子撿出洗滌后放入培養(yǎng)液中置入5%CO2(20%O2)培養(yǎng)箱，取卵2～4h后行短時授精，受精4h觀察兩極體，受精17～20h進行受精觀察和原核期評分，出現(xiàn)兩個原核(2PN)為正常受精。觀察受精后將胚胎隨機放入5%CO2(20%O2)培養(yǎng)箱和5%CO2，5%O2和90%N2的混合氣體(5%O2)培養(yǎng)箱培養(yǎng)至第3天移植，第2天及第3天各評估胚胎1次。移植2周后驗?zāi)騢CG，陽性者為生化妊娠，移植5周后B超檢查見孕囊及胚芽診斷為臨床妊娠。

1.2.3 胚胎評級 所有胚胎均在相對固定時間進行形態(tài)評價。按Brinsden［4］標(biāo)準(zhǔn)，卵裂期胚胎評分系統(tǒng)評估D2/D3胚胎質(zhì)量。Ⅰ級，胚胎卵裂球均勻規(guī)則，胞質(zhì)均質(zhì)透明，透明帶完整，胚胎無或僅有極少(＜5%)碎片;Ⅱ級，卵裂球形態(tài)輕度不均勻，胞漿折光性有輕微變化，碎片＜15%，透明帶完整;Ⅲ級，胚胎內(nèi)碎片＜20%，其余卵裂球形態(tài)同II級，透明帶完整;Ⅳ級，胚胎內(nèi)碎片＞20%，碎片外卵裂球具有活細(xì)胞特征，胞漿折光性有較大改變，胞漿變黑、顆粒不均勻;Ⅴ級，受精延遲的胚胎，或受精失敗后第2天進行重新受精發(fā)育而來的胚胎;Ⅵ級，胚胎無活性，卵裂球退化、皺縮、色深。

1.2.4 胚胎移植 第3天按胚胎分級標(biāo)準(zhǔn)選擇胚胎，Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。根據(jù)女方的年齡及周期移植2～3個形態(tài)學(xué)評分最佳(首選Ⅰ和Ⅱ級)的胚胎，剩余的優(yōu)質(zhì)胚胎行冷凍保存。

1.2.5 妊娠結(jié)局 移植后14d測血 hCG水平 ＞50U/L為生化妊娠，2周后B超見到孕囊為臨床妊娠，妊娠3個月內(nèi)流產(chǎn)為早期流產(chǎn)。

1.2.6 率的計算 優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%;胚胎利用率=可利用胚胎數(shù)(用于移植及冷凍的胚胎)/2PN卵裂數(shù)×100%;多胎率=多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%;活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，率的比較采用卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

20 %O2組221例，5%O2組398例。兩組對象年齡、不孕時間、Gn啟動劑量、獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)及hCG日內(nèi)膜厚度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 氣體培養(yǎng)環(huán)境對IVF及胚胎發(fā)育的影響

兩組受精率、卵裂率、胚胎利用率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);5%O2組的優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率均高于20%O2組(P＜0.01)。見表2。

表1 兩組對象一般情況比較(±s)

表1 兩組對象一般情況比較(±s)

分組年 齡(歲)不孕時間(年)Gn啟動劑量(支)獲卵數(shù)(枚)移植胚胎數(shù)(個)hCG日內(nèi)膜厚度(mm)20%O2組(n=221) 31.36 ±4.44 4.86 ±3.42 2.68 ±0.47 10.78 ±5.1 2.1 ±0.2 9.8 ±3.2 5%O2組(n=398) 31.57 ±4.49 4.80 ±3.23 2.70 ±0.62 10.45 ±6.2 2.2 ±0.1 10.8 ±2.4 P ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

表2 兩種O2培養(yǎng)環(huán)境對IVF結(jié)局的影響(%)

3 討論

O2是輸卵管和子宮環(huán)境的一個重要組成部分，對胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)有重要作用。無論受精卵的發(fā)育還是已進入多細(xì)胞階段的胚胎發(fā)育都需要在一定合適的O2濃度下進行，濃度過高或過低都不利于發(fā)育。兔子、嚙齒類動物的輸卵管中氧分壓在4.67～8.00kPa(5% ～8%)，恒河猴子宮中的氧分壓更低為1.5% ～2%。兔子子宮中的O2濃度在胚胎種植時會下降，從5.3%降到3.5%。已有研究表明在胚胎發(fā)育過程中將氣相環(huán)境中的O2濃度由大氣水平(20%)降到生理水平(5%)可提高胚胎的發(fā)育能力［1，2］。

本研究比較低氧(5%CO2+5%O2+90%N2)環(huán)境與含20%O2的高氧環(huán)境(5%CO2的空氣)對人胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其受精率、卵裂率及胚胎利用率無差異，但優(yōu)質(zhì)胚胎率與臨床妊娠率及活產(chǎn)率有明顯差異(P＜0.01)。優(yōu)質(zhì)胚胎率的提高提示5%O2培養(yǎng)環(huán)境可能有助于提高胚胎的發(fā)育潛能。這可能是由于處于高氧環(huán)境時，培養(yǎng)液中的氧自由基較高所致，氧自由基對胚胎有毒害作用。已有的研究表明:20%O2培養(yǎng)環(huán)境下，由于氧濃度過高，加速培養(yǎng)液中過氧化物形成，過氧化物通過過氧化膜脂損傷胚胎膜表面，還可使酶失活、DNA損傷導(dǎo)致胚胎異常發(fā)育［5～7］。而低氧條件可能有助于減少氧自由基的產(chǎn)生，從而促進胚胎的早期發(fā)育。John等［8］關(guān)于兩種氣體環(huán)境對鼠胚發(fā)育影響的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎發(fā)育的不同階段，過氧化物的產(chǎn)生量不同，胚胎對過氧化物的敏感程度也不同。過氧化物產(chǎn)生的兩個高峰是受精時及2PN期，2PN階段若其含量過高則會引起胚胎停育。Dumoulin等［2］在人類囊胚培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)對于8PN以前的胚胎，采用兩種O2濃度培養(yǎng)并無明顯差異，但5%O2環(huán)境中人類囊胚的形成率會顯著提高［10］。因此，Abeydeera等［9］提出早期胚胎的體外培養(yǎng)宜采用序貫培養(yǎng)方式，即桑椹胚以前在20%O2環(huán)境下培養(yǎng)，而桑椹胚以后的階段宜在5%O2環(huán)境中培養(yǎng)。但 Ciray等［10］的研究發(fā)現(xiàn):與受精后第3天行5%O2培養(yǎng)相比較，從受精開始即進行低氧培養(yǎng)明顯提高其第5天的囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚率。由于本中心常規(guī)第3天移植，因此無數(shù)據(jù)評估兩種氣體環(huán)境下第5天囊胚形成率的差異，但對于第3天移植胚胎培養(yǎng)結(jié)果表明，5%O2培養(yǎng)環(huán)境明顯提高其優(yōu)質(zhì)胚胎率及臨床妊娠率。因此筆者推測在胚胎發(fā)育早期進行低氧培養(yǎng)可能有助于改善胚胎活力和形態(tài)，促進胚胎的發(fā)育，形成較多的優(yōu)質(zhì)胚胎，從而有利于第5天囊胚的形成。如果在胚胎發(fā)育早期于20%O2環(huán)境下培養(yǎng)，過氧化物的產(chǎn)生可能會影響胚胎早期的代謝及基因表達(dá)，而這種損害可能在桑椹胚期或囊胚期明顯表現(xiàn)，最終影響囊胚形成［11］。

因此，本研究認(rèn)為在胚胎體外培養(yǎng)的早期即應(yīng)行5%O2環(huán)境培養(yǎng)，有利于提高胚胎發(fā)育潛能，提高妊娠率。當(dāng)然，研究還應(yīng)包括多種因素，如患者的周期數(shù)、精子的質(zhì)量等，以更客觀地了解兩種氣體培養(yǎng)環(huán)境對胚胎發(fā)育的影響。

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［責(zé)任編輯:張 璐］