李芳芳 郭 永 崔芳芳，3 丁 寧 張 嶸 鄒檢平，*

1.國家人口計生委科學(xué)技術(shù)研究所(北京，100081);2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院;3.河南大學(xué)藥學(xué)院

脆性X綜合征(FXS)是一種常見的遺傳性智力低下綜合征，其發(fā)病率僅次于唐氏綜合征，男性為1/4 000，女性為 1/6 000［1］。FXS 患者在智障人群中所占比例為2.6% ～8.7%［2］，目前尚無有效的治療方法，國外非常重視 FXS的篩查，以早期檢出FXS患者，針對性地對患兒進(jìn)行生活技能訓(xùn)練。有些國家(如以色列、芬蘭)已在孕婦中進(jìn)行常規(guī)篩查，防止患兒出生［3］。早期進(jìn)行FXS篩查診斷可以對患兒進(jìn)行早期干預(yù)，同時，對其家庭進(jìn)行完善的基因型檢測，可以指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育，防止智力低下人口的出生，從而提高人口素質(zhì)［4］。因此深入研究FXS，開發(fā)一種快速、簡便、價廉、可靠的診斷方法意義深遠(yuǎn)。脆性X智力低下蛋白(FMRP)在成人和胎兒大腦和睪丸組織內(nèi)都有高水平表達(dá)［5］，因此本研究中選擇以人腦 cDNA文庫為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得FMR1基因后在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中完成FMRP重組表達(dá)，經(jīng)親和純化得到GST-FMRP融合蛋白，為下一步FMRP抗體的制備以及FXS的快速、高通量檢測方法確立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 GST融合蛋白的表達(dá)載體pGEX-6P-1由本所張傳領(lǐng)博士惠贈;表達(dá)宿主菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根公司。1.1.2酶與試劑 人腦 cDNA文庫(質(zhì)粒 DNA)和DNA marker購自TaKaRa;谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠4B凝膠純化柱及填料購自GE Healthcare;苯甲基磺酰氟(PMSF)、還原型谷胱甘肽、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、二硫蘇糖醇(DTT)、溶菌酶及十二烷基肌氨酸鈉(NLS)購自Merck;PhusionTM超保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、dNTP、T4 DNA連接酶及蛋白Ladder購自NEB;質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購自QIAGEN;0.45μm PVDF膜及鼠抗人 FMRP單克隆抗體購自Millipore;鼠抗GST單克隆抗體及辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自中杉金橋公司;Western blotting發(fā)光試劑購自SANTA CRUZ;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 特異擴(kuò)增 FMR1的引物 根據(jù) FMR1 cDNA序列合成特異性上下游引物，在其5'和3'末端分別引入限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I的識別位點(diǎn)，所有引物均由 Invitrogen公司合成。上游引物:5'-CCGGAATTCGAGGAGCTGGTGGTGGAAG-3';下游引物:5'-CGCGTCGACTTATCCATTCACGAGTGGTTGC -3'。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-FMR1的構(gòu)建 以人腦cDNA文庫為模板PCR擴(kuò)增FMR1:98℃預(yù)變性30s，98℃變性 10s，65℃ 退火 30s，72℃ 變性 45s，35個循環(huán)后72℃10min?；厥占兓陨螾CR產(chǎn)物，用EcoR I和Sal I雙酶切;與同樣用EcoR I和Sal I雙酶切的表達(dá)載體pGEX-6P-1連接，構(gòu)建出表達(dá)FMRP前端融合GST蛋白的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR進(jìn)行陽性克隆檢測，提取陽性克隆的pGEX-FMR1質(zhì)粒后進(jìn)行測序確認(rèn)。

1.2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將pGEX-FMR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，挑取單克隆，搖床220rpm/min、37℃培養(yǎng)過夜后以1:50接種于50m l LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約2h至 OD600=0.4～1.0，加入終濃度為0.5mM 的 IPTG，誘導(dǎo) 1、3、5、7h各取1ml菌懸液4 000rpm/min離心10min收集菌體，加入500μl 1×SDS上樣緩沖液(50mM Tris-HCl，100mM DTT，2%SDS，0.1% 溴酚藍(lán)，10% 甘油)，沸水煮5min后10%SDS-PAGE進(jìn)行融合蛋白檢測。以pGEX-6P-1空載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS細(xì)胞作為對照，同時每組設(shè)立以等體積H2O代替IPTG的非誘導(dǎo)陰性對照。

1.2.3 融合蛋白的純化 挑取單克隆接種培養(yǎng)過夜后以1:50接種于50m l LB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.4 ～1.0，加入IPTG 終濃度為0.5mM 誘導(dǎo)7h，將培養(yǎng)物4 000rpm/min離心5min收集菌體，以5ml冰浴的 STE(10 mM Tris- HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1mM EDTA)洗滌菌體一次，以 3ml含100μg/ml溶菌酶的 STE重懸，冰浴15min后加入DTT至終濃度5mM，PMSF至終濃度1mM，10%NLS至終濃度1.5%。渦旋5～10s混勻，冰上超聲破碎30s，間隔 90s，共 5 次，13 000rpm/min 4℃ 離心10min。取上清，加入1ml 10%TritonX-100(終濃度3%)，渦旋5～10s，準(zhǔn)備上柱加樣。

以5ml PBS洗谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠4B填料，小于2 000rpm/min離心，棄上清，PBS重復(fù)洗滌兩次。以儲存緩沖液(50mM HEPES緩沖液，pH 7.4，150mM NaCl，5mM DTT，10% 甘油)重懸裝柱，加入處理好的樣品。以1ml Elution緩沖液(75mM HEPES 緩沖液，pH 7.4，150mM NaCl，5mM DTT，10mM還原型谷胱甘肽，0.1%Triton X-100)洗脫。收集洗脫液，每管約100μl，SDS-PAGE檢測每管洗脫液。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-FMR1的構(gòu)建

以人腦cDNA文庫為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得FMR1基因(圖 1)。經(jīng)膠回收、雙酶切、連接至pGEX-6P-1載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。菌落PCR檢測出兩個陽性克隆(圖2)，瓊脂糖凝膠電泳顯示產(chǎn)物略小于2 000bp，與預(yù)期結(jié)果一致。提取陽性克隆的質(zhì)粒由華大基因公司進(jìn)行序列測定，確保編碼區(qū)準(zhǔn)確、無突變。測序結(jié)果經(jīng)NCBI在線BLAST，結(jié)果顯示11號陽性克隆序列與FMR1 transcript variant ISO10一致，為1 640bp，12號陽性克隆序列與transcript variant ISO7一致，為1 836bp。

圖1 PCR擴(kuò)增的FMR1基因的凝膠電泳圖

圖2 PCR鑒定菌落含陽性重組克隆菌

2.2 融合蛋白GST-FMRP的表達(dá)

pGEX-FMR1 ISO10和pGEX-FMR1 ISO7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS宿主菌。FMR1 ISO7為1 836bp，可編碼蛋白約68.9kDa;FMR1 ISO10大小為 1 640bp，可編碼蛋白大小約 48.7kDa。含pGEX-FMR1 ISO10質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)0.5mM IPTG誘導(dǎo)，在約75 kDa處有明顯蛋白表達(dá)，與預(yù)期結(jié)果相符(FMRP ISO10為 48.7kDa，GST標(biāo)簽蛋白約26kDa)有文獻(xiàn)報道對于FMRP的大腸桿菌重組表達(dá)、真核細(xì)胞重組表達(dá)及體外表達(dá)由于產(chǎn)量過低都不夠理想［6］。本實(shí)驗(yàn)中含pGEX-FMR1 ISO7質(zhì)粒的宿主菌，經(jīng)0.5mM IPTG誘導(dǎo)在預(yù)期的約95 kDa處(FMRP ISO7為 68.9kDa，GST標(biāo)簽蛋白約26kDa)也沒有明顯蛋白表達(dá)(圖3)。

圖3 SDS-PAGE分析融合蛋白GST-FMRP ISO10及ISO7的表達(dá)差異

2.3 融合蛋白GST-FMRP ISO10的純化

谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠4B凝膠柱和NLS應(yīng)用在GST-FMRP ISO10的純化過程中。10%SDSPAGE和 Western blot檢測蛋白純化產(chǎn)物，SDSPAGE凝膠電泳顯示純化蛋白約為75kDa(圖4)，對純化產(chǎn)物以鼠抗人FMRP單克隆抗體和鼠抗GST單克隆抗體分別進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果均呈陽性(圖5)。

3 討論

FXS成因是脆性X智力低下基因1(FMR1)所編碼的FMRP的表達(dá)降低或缺失。FMR1基因位于X染色體的長臂遠(yuǎn)端 Xq27.3區(qū)的脆性部位，由17個外顯子和16個內(nèi)含子組成，全長約38kb，在哺乳動物間高度保守［7］。FMR1基因5'非翻譯區(qū)存在一段數(shù)目可變的(CGG)n重復(fù)序列，其上游250bp處存在一個CpG島。(CGG)n三核苷酸重復(fù)序列的異常擴(kuò)增、CpG島的異常甲基化以及基因缺失和基因點(diǎn)突變都可導(dǎo)致FMR1的非正常翻譯，引起FMRP表達(dá)降低甚至缺失，從而造成臨床癥狀［8，9］。

圖4 SDS-PAGE電泳分析親和純化產(chǎn)物GST-FMRP ISO10

圖5 Western blot分析蛋白純化產(chǎn)物GST-FMRP ISO10

至今對于FXS已有多種篩查和診斷方法，以PCR技術(shù)、細(xì)胞遺傳學(xué)方法和Southern blot方法應(yīng)用最廣，然而每種方法均存在各自的局限性，所以對FXS簡易、快速診斷方法的研究仍是熱點(diǎn)之一。FXS最終取決于FXS患者各種組織尤其是神經(jīng)細(xì)胞的FMRP表達(dá)水平，F(xiàn)MRP的缺失與否可以作為FXS診斷的分子標(biāo)記，Willemsen等［10］創(chuàng)立的FMRP免疫細(xì)胞化學(xué)方法—快速抗體檢測法檢測FMRP水平，比細(xì)胞遺傳學(xué)方法和基因檢測方法能更直接反映和解釋FXS患者的臨床表現(xiàn)［11］。應(yīng)用抗體法檢測FMRP的表達(dá)可以篩查出包括FMR1基因內(nèi)(CGG)n重復(fù)序列的不穩(wěn)定擴(kuò)增，CpG島的異常甲基化，以及編碼區(qū)發(fā)生缺失或錯義點(diǎn)突變等各種原因所致的FXS。所以開發(fā)針對FMRP檢測高效、快速、高通量的FXS篩查方法迫在眉睫［12］。但目前國內(nèi)進(jìn)行FMRP快速抗體檢測所采用的多為進(jìn)口人FMRP單克隆抗體，還需配備免疫組化染色等相關(guān)試劑［4，11］，無完整的試劑盒，不僅價格昂貴，而且由于配套試劑的不統(tǒng)一，可能會影響檢測結(jié)果的可比性。我們的目標(biāo)是制備出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的、特異性高、親合性強(qiáng)的人FMRP單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上，輔以全套抗體檢測法所需試劑，開發(fā)成為FXS檢測試劑盒，降低FXS檢查成本，簡化實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，方便使用。

FMR1基因因其復(fù)雜的選擇性剪接而有多種剪接異構(gòu)體，理論上人類FMRP剪接異構(gòu)體至少可能有20種［13］。主要涉及外顯子12和14，以及外顯子15和17的多個選擇性剪接位點(diǎn)［14］。目前，已有5種剪接異構(gòu)體在不同組織內(nèi)檢測到［15］。FMR1 ISO7與FMR1 ISO1全序列相比，缺少外顯子12(共63bp)，全長1 836bp，針對FMRP ISO7的重組表達(dá)實(shí)驗(yàn)遇到蛋白表達(dá)量過低的問題，加入IPTG后宿主菌生長受抑制，OD600檢測其菌體濃度低于非誘導(dǎo)對照組。此外，實(shí)驗(yàn)中通過改變IPTG誘導(dǎo)濃度(0.125、0.25、0.5、1、2、4 mM)及調(diào)整誘導(dǎo)表達(dá)溫度(25℃及37℃)都不能增加FMRP ISO7的蛋白表達(dá)量，無法進(jìn)行純化;FMR1 ISO10缺少外顯子12和14，全長1 640 bp，由于外顯子14包含196bp，所以造成其后閱讀框移碼，出現(xiàn)翻譯提前終止密碼子。真核細(xì)胞中，無義突變介導(dǎo)的mRNA降解能夠選擇性地降解含有PTC的mRNA［16］。但本研究在大腸桿菌 BL21(DE3)pLysS中成功地將FMR1 ISO10在PTC之前序列部分進(jìn)行重組表達(dá)和純化。FMRP含有兩種類型的RNA結(jié)合序列:兩個KH結(jié)構(gòu)域和一個RGG框［17］。FMRP ISO10含有兩個KH結(jié)構(gòu)域，所以制備的抗體可以應(yīng)用于FXS檢測，并且可以彌補(bǔ)FMRP ISO7及ISO1等表達(dá)量低的不足。此外，雖然大部分GST融合蛋白是可溶性的，但當(dāng)有不溶性包涵體存在時，陰離子表面活性劑NLS可起到溶解作用［18］，所以GST促溶標(biāo)簽及NLS的應(yīng)用解決了蛋白純化的困難。整套FMRP ISO10的表達(dá)純化系統(tǒng)為FMRP單克隆抗體制備及FXS檢測試劑盒的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，對于FXS篩查，做出早期診斷，防止智力低下人口的出生，提高人口素質(zhì)有著深遠(yuǎn)意義。

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［責(zé)任編輯:王麗娜］