吳衛(wèi)東，荊西民，岳靜靜

脂聯(lián)素受體（adiponectin receptor，AdipoR）分為兩種，脂聯(lián)素受體1（AdipoR1）和脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）?，F(xiàn)有的研究證實(shí)，在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中兩種AdipoR都有表達(dá)，且動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與血管組織AdipoR1表達(dá)下調(diào)相關(guān)，有學(xué)者稱這種現(xiàn)象為脂聯(lián)素抵抗［10］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［1，2］，有氧運(yùn)動(dòng)能有效地延緩和抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，是防治動(dòng)脈粥樣硬化的重要手段。運(yùn)動(dòng)能否通過增加主動(dòng)脈AdipoR1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高脂聯(lián)素的作用效率達(dá)到防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用，相關(guān)研究鮮見報(bào)道。本研究以ApoE基因缺陷小鼠為動(dòng)物模型，通過觀察運(yùn)動(dòng)對主動(dòng)脈AdipoR1蛋白表達(dá)的影響，探討運(yùn)動(dòng)防治動(dòng)脈粥樣硬化的另一可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8周齡雄性ApoE基因缺陷小鼠20只，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分為安靜組（C組，10只）和運(yùn)動(dòng)組（E組，10只）。兩組均以二級條件飼養(yǎng)，飼以高脂膳食飼料（含21％脂肪，0.15％膽固醇，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部）。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

E組小鼠每日上午9：00～10：00進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，遞增運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間，每周5次，共14周。小鼠運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、遞增運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間參考Fernando［6］等的研究確定。前6周由10 m/min×30 min逐漸遞增至13 m/min×60 min，后8周開始穩(wěn)定在13 m/min×60 min，跑臺(tái)坡度為0°。

1.3 取材與指標(biāo)檢測

第14周末，所有小鼠處死取血，4℃3 000 rpm離心10 min，制備血清，用DEPC水進(jìn)行心臟血管在體灌流，然后取出主動(dòng)脈，取腎周和附睪脂肪墊放入DEPC水中沖洗表層血液，并用濾紙吸干。取材前E組小鼠停止運(yùn)動(dòng)48 h，禁食過夜。

主動(dòng)脈病理形態(tài)觀察：標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛固定4 h后，OCT包埋，進(jìn)行冰凍切片，切片厚度10μm，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察血管彈力纖維板的斷裂情況。

血清脂聯(lián)素含量測定：采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫（ABCELISA）方法，試劑盒購自美國R＆D公司。

脂肪組織脂聯(lián)素m RNA測定：RT－PCR法檢測。采用Trizol一步法提取總RNA，采用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)次數(shù)的PCR。引物序列檢索自NCBI－Nucleotide數(shù)據(jù)庫，脂聯(lián)素引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度196 bp，上游引物：5’－AATCATTATGACGGCAGCAC－3’，下游引物：5’－CCAGATGGAGGAGCACAGAG－3’；Beta－Actin擴(kuò)增產(chǎn)物長度511 bp，上游引物5’－CCATCTACGAGGGCTATGCT－3’，下游引物5’－CAAGAAGGAAGGCTGGAAAA－3’。

主動(dòng)脈AdipoR1蛋白測定：Western免疫印跡檢測。將主動(dòng)脈勻漿后離心（16 000 rpm，30 min）取上清，標(biāo)定蛋白濃度上樣后，經(jīng)12％的SDS－PAGE電泳分離。將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5％的脫脂奶粉封閉，TBST沖洗后加兔抗鼠AdipoR1一抗4℃過夜。TBST液沖洗，加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗孵育，NBT/BCIP顯色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.5數(shù)據(jù)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±SD）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 主動(dòng)脈血管壁HE染色觀察結(jié)果

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，C組小鼠主動(dòng)脈血管壁纖維板分裂成多層狀，出現(xiàn)間隙，斷裂嚴(yán)重，內(nèi)膜失去原有的波浪狀，E組小鼠主動(dòng)脈血管壁彈力纖維排列致密，偶有斷層，內(nèi)膜較完整（圖1）。

圖1 兩組小鼠主動(dòng)脈竇橫截面HE染色觀察圖（LM×200，a為C組，b為E組）

2.2 脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)及其血清水平

表1顯示，14周實(shí)驗(yàn)后E組小鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)顯著高于C組（P＜0.05），其血清脂聯(lián)素水平同樣顯著高于C組（P＜0.01）。

表1 本研究兩組小鼠脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)及血清脂聯(lián)素含量比較一覽表

圖2 脂聯(lián)素mRNA表達(dá)水平示意圖（M：標(biāo)準(zhǔn)DNA；E：運(yùn)動(dòng)組；C：安靜組）

2.3 主動(dòng)脈AdipoR1蛋白表達(dá)水平

表2顯示，E組小鼠經(jīng)過14周有氧運(yùn)動(dòng)后主動(dòng)脈AdipoR1蛋白表達(dá)顯著高于C組（P＜0.05）。

表2 本研究兩組小鼠主動(dòng)脈AdipoR1蛋白表達(dá)比較一覽表

圖3 Western Blot檢測AdipoR1蛋白的表達(dá)圖（E：運(yùn)動(dòng)組；C：安靜組）

3 討論

3.1 有氧運(yùn)動(dòng)通過脂聯(lián)素及其受體1發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的可能機(jī)制

從主動(dòng)脈冰凍切片的結(jié)果來看，C組小鼠主動(dòng)脈血管壁纖維板分裂成多層狀，出現(xiàn)間隙，斷裂嚴(yán)重，內(nèi)膜失去原有的波浪狀。在C組小鼠主動(dòng)脈血管壁纖維彈力板斷裂、內(nèi)膜完整性破壞后，主要位于動(dòng)脈中層的通過彈力板與內(nèi)膜隔開的平滑肌細(xì)胞會(huì)從中膜遷移到內(nèi)膜。結(jié)果會(huì)使遷移至內(nèi)膜的平滑肌細(xì)胞聚集在由壞死的泡沫細(xì)胞組成的脂池周圍，由收縮型演變?yōu)楹铣尚?，產(chǎn)生膠原纖維和彈力纖維組成纖維帽包繞脂池形成典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。隨著病變的發(fā)展，血管會(huì)首先出現(xiàn)外向型重塑，主要表現(xiàn)為血管壁增厚并向外擴(kuò)大而管腔并不狹窄。如果動(dòng)脈粥樣硬化斑塊繼續(xù)生長超過橫截面積的40％，則開始出現(xiàn)負(fù)向重塑，血管腔出現(xiàn)狹窄［3］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E組小鼠主動(dòng)脈血管壁纖維彈力板和內(nèi)膜相對C組較完好，提示，有氧運(yùn)動(dòng)有效延緩了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

脂聯(lián)素是脂肪組織合成分泌的細(xì)胞因子，且有隨內(nèi)臟脂肪組織減少，基因表達(dá)水平升高的趨勢，Stefan等［11］的研究證實(shí)，其在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。臨床資料顯示，脂聯(lián)素與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的許多環(huán)節(jié)密切相關(guān)［7］，在健康人血液中含量豐富，但在動(dòng)脈粥樣硬化患者血液中的濃度卻顯著降低。本研究結(jié)果顯示，E組小鼠經(jīng)過14周有氧運(yùn)動(dòng)的訓(xùn)練后，脂聯(lián)素的基因表達(dá)和血清水平都有顯著提高，提示，E組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展要慢于C組小鼠。

脂聯(lián)素要發(fā)揮作用必須通過受體的介導(dǎo)才能實(shí)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化血管AdipoR顯著下降，可能是導(dǎo)致血管損傷的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，E組小鼠AdipoR1蛋白表達(dá)明顯增加，動(dòng)脈病變較C組明顯改善，內(nèi)膜完整性較好。分析其機(jī)制可能有：第一，運(yùn)動(dòng)干預(yù)同時(shí)上調(diào)了血清脂聯(lián)素和AdipoR1蛋白表達(dá)，脂聯(lián)素與AdipoR1結(jié)合效率提高，直接作用于血管的病變部位，抑制主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的血管粘附分子（VCAM）－1、E－選擇素及細(xì)胞間粘附分子（ICAM）－1等，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［9］；第二，脂聯(lián)素與AdipoR1結(jié)合可激活A(yù)MP活化蛋白激酶（AMPK），抑制糖異生相關(guān)因子的表達(dá)，增加乙酰輔酶A羧化酶的磷酸化，增強(qiáng)脂肪酸的氧化和葡萄糖的攝取，還可以通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα），增強(qiáng)脂肪酸的氧化，降低甘油三酯（TG）的濃度，有效延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［8］。

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)對AdipoR1蛋白表達(dá)影響的可能機(jī)制

本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可以使主動(dòng)脈AdipoR1蛋白表達(dá)顯著增加，分析其可能機(jī)制有：1）胰島素對Adipo R1的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Christiansen T［5］的研究發(fā)現(xiàn)，降低血液中胰島素的水平可以使AdipoR1表達(dá)顯著增加，反之，注射胰島素可顯著抑制其表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過14周的有氧運(yùn)動(dòng)，AdipoR1蛋白表達(dá)顯著增加，這可能是有氧，的攝取和減少肝糖的異生，同時(shí)，血液中胰島素水平降低，使Adipo R1的表達(dá)處于脫抑制的狀態(tài)。2）過氧化物增殖活化受體γ（PPARγ）的調(diào)控。Chinetti等人［4］研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞上的Adipo R受到PPARγ調(diào)控，PPARγ增加可以顯著增強(qiáng)AdipoR的表達(dá)。有氧運(yùn)動(dòng)可以通過激活PPARγ的表達(dá)改善由肥胖引起的胰島素抵抗，提高AdipoR1蛋白的表達(dá)。

4 小結(jié)

本研究表明，運(yùn)動(dòng)可以提高血清脂聯(lián)素水平、脂聯(lián)素mRNA及AdipoR1蛋白表達(dá)，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的作用，這可能是運(yùn)動(dòng)抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的另一機(jī)制。

［1］陳近利，陳吉棣.有氧運(yùn)動(dòng)和膳食脂肪對ApoE基因缺陷小鼠已經(jīng)形成的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用［J］.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2001，20（3）：228－231.

［2］李則一，陳吉棣.有氧運(yùn)動(dòng)對ApoE基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響［J］.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2000，19（3）：256－260.

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