曹 婧

鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州 450052

膀胱癌是非常常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，目前我們對(duì)膀胱癌采取的主要治療方法是手術(shù)切除，術(shù)后化療，必要時(shí)放療，但療效不很理想。中藥靛玉紅是我國(guó)創(chuàng)制的治療慢性粒細(xì)胞白血病的有效藥物，它的抗腫瘤作用原理主要為抑制DNA聚合酶，影響DNA的聚合過(guò)程，從而使DNA合成受抑制。Nanog基因?yàn)橐慌c腫瘤干細(xì)胞有關(guān)的胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，它能夠在誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化中發(fā)揮功能。靛玉紅對(duì)實(shí)體瘤及其相關(guān)基因表達(dá)的作用還有待研究。由此，該實(shí)驗(yàn)將不同濃度的靛玉紅作用于人膀胱癌細(xì)胞株，并進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)Nanog基因的表達(dá)抑制情況。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、甲基四唑藍(lán)、二甲基亞砜（DMSO ）、胰蛋白酶、靛玉紅粉劑、EDTA、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、DEPC、DNA marker、 無(wú)水乙醇、RNA提取試劑盒，One-step RTPCR試劑盒。人膀胱癌細(xì)胞株。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組：不加靛玉紅；實(shí)驗(yàn)組：加入的靛玉紅最終濃度分別為 1 μmol/L（A 組）、5 μmol/L （B 組）、10 μmol/L（C 組），傳代后培養(yǎng)液內(nèi)已加入不同濃度的藥物。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

RPMI1640培養(yǎng)液中含有10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、鏈霉素及濃度分別為0、1、5、10μmol/L的靛玉紅，膀胱癌細(xì)胞株在上述培養(yǎng)液中按常規(guī)方法體外培養(yǎng)。每組共3瓶細(xì)胞，其中1瓶用于傳代，2瓶用于收集。持續(xù)傳代培養(yǎng)1個(gè)月，并收集每組各代細(xì)胞，凍存于-40℃冰箱中。

1.4 細(xì)胞RNA提取及NanogmRNA的表達(dá)檢測(cè)

用RNA提取試劑盒提取凍存的各組各代細(xì)胞RNA，將RNA用one-step RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并分析其與內(nèi)參的灰度比。Nanog 上游引物為 5’-ATG CCT CAC ACG GAG ACTGT-3’，下游 5’-AGG GCT GTC CTG AAT AAG CA-3’，片段長(zhǎng)度為66bp；內(nèi)參 β-actin上游引物 5’-CAT CCT GCG GCT GGA CCT-3’，下游 5’-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3’，片段長(zhǎng)度為480bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)Nanog基因mRNA的表達(dá)隨靛玉紅作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。見(jiàn)圖1。

選取靛玉紅作用9 d為同一觀察時(shí)相。即對(duì)照組和A組傳代至第三代細(xì)胞，B組為第二代，C組仍為第一代細(xì)胞。結(jié)果顯示，1、5、10μmol/L靛玉紅均可抑制Nanog基因mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且抑制作用隨濃度增加逐漸增強(qiáng)，4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度靛玉紅對(duì)Nanog mRNA表達(dá)影響（±s）

表1 不同濃度靛玉紅對(duì)Nanog mRNA表達(dá)影響（±s）

注：各組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,且4組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

藥物濃度（μmol/L） Nanog與內(nèi)參β-actin灰度比0151 0 0.581±0.017 0.463±0.018 0.212±0.035 0.158±0.041

3 討論

我國(guó)膀胱癌發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)腫瘤第1位，其中90%以上為移行細(xì)胞癌。由于其術(shù)后輔助治療療效不甚理想，尋找新的、有效的抗膀胱癌細(xì)胞增殖的藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。中藥在抗腫瘤方面愈發(fā)顯出優(yōu)勢(shì)，從中藥中尋找新的抗腫瘤藥物已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。靛玉紅是從傳統(tǒng)中藥青黛中提取的有效成分，對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病有明顯療效。其作用原理主要為抑制DNA聚合酶，影響DNA聚合過(guò)程，從而使DNA合成受抑制。除此之外，其抗癌作用還可能與提高機(jī)體免疫功能有關(guān)。目前靛玉紅主要用于對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病的治療，對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞的抑制作用研究進(jìn)行得較少。

腫瘤干細(xì)胞研究目前成為腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的一個(gè)熱門(mén)領(lǐng)域，腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、復(fù)發(fā)有密切關(guān)系[1]。膀胱癌的復(fù)發(fā)率較高，與腫瘤干細(xì)胞無(wú)法被化療藥物殺死，在體內(nèi)長(zhǎng)期存在也有關(guān)。探討干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展及與其有關(guān)的基因并尋找通過(guò)此途徑發(fā)揮抗癌作用的藥物，已成為腫瘤治療的新途徑，值得進(jìn)行深入研究。Nanog是新發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，在保持胚胎干細(xì)胞多能性的機(jī)制中有重要作用，是具有同源結(jié)構(gòu)域的基因。Nanog在胚胎干細(xì)胞即ES細(xì)胞有很強(qiáng)的表達(dá)，另外，它在胚胎生殖細(xì)胞和胚胎癌細(xì)胞中也都有表達(dá)。而目前對(duì)Nanog的表達(dá)調(diào)控，尚有待進(jìn)一步研究。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Nanog的表達(dá)水平在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)隨時(shí)間下降。作用時(shí)間相同時(shí)，Nanog與內(nèi)參的灰度比隨藥物濃度上升而逐漸下降。證明靛玉紅能夠抑制膀胱癌細(xì)胞株中Nanog基因的表達(dá)，且抑制作用隨時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度增加而增強(qiáng)。這對(duì)進(jìn)一步發(fā)掘其抗腫瘤作用機(jī)制，開(kāi)辟其應(yīng)用的新途徑提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

[1]KurisakiA，Hamazaki TS.Chromatin-related proteins in pluripotentmouse embryonic stem cells are downregulated after removal of leukemia inhibitory factor[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，335(3):667-675.