任曉利， 劉太國(guó)， 劉 博， 高 利， 陳萬(wàn)權(quán)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

小麥葉銹病是影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一，在世界各小麥種植區(qū)域均有分布。我國(guó)小麥葉銹病以西南、長(zhǎng)江流域麥區(qū)發(fā)生較重，華北、東北麥區(qū)曾造成嚴(yán)重?fù)p失，成為生產(chǎn)上一個(gè)重要問(wèn)題［1－2］。篩選和培育抗病品種是防治小麥葉銹病最為經(jīng)濟(jì)、安全和有效的方法。然而，由于抗葉銹品種的單一化種植和小麥葉銹菌新毒性的產(chǎn)生，經(jīng)常導(dǎo)致品種抗銹性的“喪失”。因此，深入研究小麥葉銹病抗源及抗性基因是抗病育種的基礎(chǔ)［3］。

截至2010年，小麥中已發(fā)現(xiàn)近100多個(gè)抗葉銹基因，其中72個(gè)被正式命名，67個(gè)被定位，39個(gè)抗病基因被標(biāo)記［4］。來(lái)源于黑麥的Lr26與抗條銹基因Yr 9、抗稈銹基因Sr31、抗白粉基因Pm8連鎖，廣泛用于我國(guó)小麥抗病育種中，該基因與其他抗性基因復(fù)合存在可提高抗病性［5］。Lr20發(fā)現(xiàn)于普通小麥中，定位于染色體7 AL上，是抗白粉病基因Pm1和抗稈銹病基因Sr15基因簇的一部分。Lr20低溫下對(duì)溫度反應(yīng)不敏感，表現(xiàn)有效的抗葉銹性，但當(dāng)溫度高于30．5℃時(shí)，完全失去抗銹作用［5］。Lr9 和Lr 19至今在我國(guó)表現(xiàn)很好的抗葉銹性，仍是有效的抗葉銹基因，在生產(chǎn)上有很大的利用價(jià)值［6］。

Lr9［7－8］、Lr19［9－10］、Lr20［11］、Lr26［12－14］等 17 個(gè) 抗葉銹病基因的RFLP、RAPD、AFLP標(biāo)記已轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定簡(jiǎn)便的STS（sequence tagged site，STS）、SCAR（sequence characterized amplified regions，SCAR）等標(biāo)記，可以應(yīng)用于分子輔助鑒定，為基因檢測(cè)開(kāi)辟了簡(jiǎn)捷可靠的途徑。1988年Chamberian［15］等率先提出了多重PCR（multiplex poly merase chain reaction，MPCR）檢測(cè)技術(shù)，即在同一反應(yīng)體系中加入一對(duì)以上的引物，針對(duì)幾個(gè)靶位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行特異性擴(kuò)增的PCR快速檢測(cè)技術(shù)［16］。與單一基因分子標(biāo)記的PCR相比，多重PCR在一次PCR中就可檢測(cè)幾個(gè)目標(biāo)基因，同時(shí)該技術(shù)快速、簡(jiǎn)便、靈敏、可靠，從而使工作效率顯著提高，成本明顯降低。Procunier［17］構(gòu)建了小麥抗葉銹基因Lr29－Lr25的復(fù)合PCR體系，可以在一次PCR中同時(shí)檢測(cè)小麥品系中是否含有Lr29和Lr25。Su míková等［18］構(gòu)建了小麥抗葉銹病基因Lr26－Lr37的復(fù)合PCR體系，檢測(cè)了21個(gè)冬小麥品種，結(jié)果表明Lr37存在于4個(gè)品種中，一個(gè)品種含有Lr26，3個(gè)品種同時(shí)含有Lr26和Lr 37。孟顥光［19］等利用小麥條銹菌和葉銹菌的特異性SCAR標(biāo)記引物，進(jìn)行小麥銹菌的復(fù)合PCR檢測(cè)，可準(zhǔn)確區(qū)分小麥條銹菌和葉銹菌，提高檢測(cè)效率。Ma W等［20］利用3對(duì)特異性引物構(gòu)建了多重PCR反應(yīng)體系，可以在一個(gè)PCR反應(yīng)中檢測(cè)3個(gè)小麥高分子量麥谷蛋白基因Glu－A1的Ax2＊亞基、Glu－B1的Bx7和Bx17亞基和Glu－D1的Dx5亞基4種基因型。而目前小麥抗葉銹病基因Lr9－Lr26、Lr19－Lr20的復(fù)合PCR檢測(cè)體系尚未見(jiàn)報(bào)道。傳統(tǒng)的抗病基因推導(dǎo)耗時(shí)、低效、需銹菌培養(yǎng)與接種鑒定，無(wú)法滿足育種家對(duì)抗病育種要求，因此，利用已知小麥抗葉銹病基因分子標(biāo)記，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速和有效的多重PCR技術(shù)對(duì)加快其在抗病育種上的應(yīng)用，縮短育種年限，加快后代抗病品種準(zhǔn)確選擇，促進(jìn)小麥抗葉銹病分子標(biāo)記輔助育種的實(shí)用化具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料

以春小麥‘Thatcher’為背景的28個(gè)已知抗葉銹病小麥近等基因系和16個(gè)已知基因載體品系中，Lr14a引自美國(guó)農(nóng)業(yè)部禾谷類(lèi)銹病室，Lr37引自法國(guó)，Lr38的載體品系為‘Zhong＃4’（A inter mediu m）［21］，其余均由國(guó)際玉米小麥改良中心（CI MMYT）提供。

供試的116個(gè)待測(cè)小麥品種（系）絕大多數(shù)屬中國(guó)目前小麥主產(chǎn)區(qū)（16個(gè)省、市、自治區(qū)）大面積種植的生產(chǎn)品種和2004年、2005年通過(guò)國(guó)家小麥品種審定委員會(huì)審定的品種及一些新育成品種，如蘭天系和中梁系品種（系）（表1）。

1．2 STS分析

參照Gill等［22］提供的CTAB法提取小麥苗基因組DNA，并經(jīng)改進(jìn)。根據(jù)已報(bào)道Lr9和Lr26的STS標(biāo)記序列（表2），由上海生工生物工程有限公司合成引物。擴(kuò)增試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)2次。

PCR反應(yīng)體系為10μL，含5μL 2×Taq Plus PCR Master Mix，每條引物（5μmol／L）0．5μL，模板DNA 100 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃，3 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳后EB染色，用伯樂(lè)公司Gene－Doc凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。

Lr9－Lr26復(fù)合 PCR反應(yīng)體系為20μL，含10μL 2×Taq Pl us PCR Master Mix，Lr26 每條引物（5μmol／L）0．5μL，Lr9 每條引物（5μmol／L）1μL，模板DNA 100 ng；Lr19－Lr20 復(fù)合PCR反應(yīng)體系為20μL，含10μL 2×Taq Plus PCR Master－Mix，Lr20 每條引物（5μmol／L）0．5μL，Lr19 每條引物（5μmol／L）1μL，模板 DNA 100 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃，3 min；94℃1 min，60℃1 min，72℃2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳后EB染色，用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。

表1 供試116個(gè)小麥品種（系）的名稱(chēng)和系譜

續(xù)表1

表2 用于抗葉銹基因鑒定的STS分子標(biāo)記

2 結(jié)果與分析

2．1 STS標(biāo)記的特異性檢測(cè)

用以春小麥‘Thatcher’為背景的28個(gè)近等基因系和16個(gè)已知基因載體品系材料對(duì)Lr9、Lr26、Lr19和Lr20的STS標(biāo)記進(jìn)行特異性檢測(cè)，Lr9、Lr26、Lr19和Lr20的STS標(biāo)記成功地從近等基因系Tc Lr9、Tc Lr26、Tc Lr19和Tc Lr20中擴(kuò)增出1 000、210、130 bp和542 bp DNA條帶，與報(bào)道片段大小相同（表2），在其他43個(gè)小麥材料（包括近等基因系輪回親本‘Thatcher’）中未擴(kuò)增出特異性DNA片段，證明標(biāo)記STSLr9、STSLr26、STSLr19和STSLr20具有選擇特異性（圖1～4）。

2．2 供試小麥品種的PCR檢測(cè)

各供試小麥品種基因組DNA 重復(fù)擴(kuò)增STS 2次，結(jié)果表明116個(gè)小麥品種中47個(gè)品種：‘石4185’（L4，表1第4號(hào)，下同）、‘邯6172’（L8）、‘邯4564’（L11）、‘綿陽(yáng)28’（L16）、‘小偃22’（L18）、‘京東8號(hào)’（L20）、‘淮麥20’（L23）、‘濰麥8號(hào)’（L25）、‘魯麥1號(hào)’（L34）、‘陜229’（L35）、‘高優(yōu)503’（L37）、‘鄭麥98’（L38）、‘綿農(nóng)4號(hào)’（L40）、‘衡95觀26’（L41）、‘蘭天10號(hào)’（L42）、‘周麥16’（L45）、‘山農(nóng)664’（L46）、‘宛麥369’（L47）、‘GS鄭麥004’（L56）、‘周麥17’（L57）、‘冀麥21’（L59）、‘衡5229’（L61）、‘連麥2號(hào)’（L68）、‘周麥18’（L70）、‘泛麥5號(hào)’（L71）、‘百農(nóng) AK58’（L72）、‘許麥29’（L79）、‘衡7228’（L80）、‘河?xùn)| TX－006’（L81）、‘蘭天11’（L83）、‘蘭天14’（L85）、‘蘭天20’（L90）、‘蘭天21’（L91）、‘蘭天22’（L92）、‘中梁22’（L94）、‘中梁24’（L95）、‘中梁9589’（L100）、‘A3－5’（L101）、‘天9633－5’（L102）、‘輪選987’（L105）、‘徐856’（L106）、‘石家莊8號(hào)’（L107）、‘花培5號(hào)’（L108）、‘項(xiàng)麥986’（L110）、‘鄭麥9694’（L113）、‘洛麥21’（L114）和‘04中3604’（L115）可擴(kuò)增出1條210 bp的Lr26特異性DNA條帶，而其他品種中未檢測(cè)到該條帶（圖5）；‘中梁26’可擴(kuò)增出1條130 bp的Lr19特異性DNA片段（圖6），116個(gè)品種中未擴(kuò)增出與近等基因系材料Tc Lr 9和Tc Lr 20特異性目的DNA片段相同的產(chǎn)物（圖7和圖8）。

圖5 116個(gè)供試小麥品種Lr26 STS標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果（1～116為品種編號(hào)，名稱(chēng)見(jiàn)表1）

2．3 供試小麥品種的Lr9－Lr26和Lr19－Lr20的復(fù)合PCR檢測(cè)

化PCR反應(yīng)體系和循環(huán)條件，構(gòu)建Lr9－Lr26和Lr 19－Lr20的復(fù)合PCR體系。結(jié)果表明，引物組合A：（Lr9 J13／1，Lr9 J13／2）和（Lr26F：IB，Lr26 R：IB）可以專(zhuān)一性擴(kuò)增出抗葉銹基因Lr9和Lr 26的1 000 bp和210 bp特異性DNA片段（圖9）；引物組合 B：（Lr19Gb F，Lr19Gb R）和 （Lr20STS638－L，Lr20STS638－R）可以專(zhuān)一性擴(kuò)增出抗葉銹基因Lr19和Lr20的130 bp和542 bp特異性DNA片段（圖10）；Lr19、Lr20和Lr26的特異性DNA序列見(jiàn)圖11－圖13。供試小麥品種Lr9－Lr26和Lr19－Lr20的復(fù)合PCR檢測(cè)（圖略），擴(kuò)增結(jié)果與單個(gè)Lr9、Lr26、Lr19和Lr20的PCR檢測(cè)的結(jié)果一致。

圖13 Lr26特異片段序列（圖中下劃線字母為引物序列）

3 討論

多重PCR較單個(gè)PCR高效、靈敏、特異且易區(qū)分，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但其對(duì)試驗(yàn)條件要求比較嚴(yán)格，如何提高多重PCR的穩(wěn)定性和重復(fù)性是該技術(shù)能否大規(guī)模應(yīng)用于分子育種輔助選擇的關(guān)鍵。引物的特異性是PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵，而MPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化則是多重PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵，基于常規(guī)循環(huán)量下，模板、各引物濃度及適宜退火溫度起了決定作用。初次進(jìn)行多重反應(yīng)時(shí)，首先選擇引物退火溫度相近，引物間二聚體較少的組合；本試驗(yàn)根據(jù)引物組合A和B中的各個(gè)引物的退火溫度設(shè)定了從52～67℃的12個(gè)退火溫度梯度，并且各種引物按相等的摩爾數(shù)添加，模板也按相等的摩爾數(shù)添加，摸索出最適的退火溫度；然后根據(jù)要增加“弱”基因的引物量，而要減少“強(qiáng)”基因的引物量的原則，改變反應(yīng)中各種引物的比例；復(fù)合PCR的程序仍舊遵循單個(gè)PCR的程序。

對(duì)于建立在PCR技術(shù)上的特異性引物分子標(biāo)記，只需極少的DNA樣品即可快速、可靠、便捷地檢測(cè)和追蹤，不受環(huán)境影響，因而成為首選的檢測(cè)方法；尤其是與抗病基因緊密連鎖的單一位點(diǎn)有無(wú)的STS標(biāo)記，可直接在PCR管中加入溴化乙錠，通過(guò)在紫外燈下觀察有無(wú)熒光來(lái)判斷有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，比較DNA間的差異，省略電泳步驟，使檢測(cè)方法變得方便、快速地檢測(cè)大量個(gè)體。而在一次擴(kuò)增中獲得兩個(gè)或多個(gè)STS標(biāo)記的多重PCR無(wú)疑較單個(gè)PCR具有更高的擴(kuò)增效率，較低的成本，節(jié)約試驗(yàn)樣品，可獲得更為豐富的信息。因此，在更多與抗病基因緊密連鎖特異性分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)上，復(fù)合PCR技術(shù)應(yīng)用于抗病育種的分子標(biāo)記輔助選擇具有廣泛的應(yīng)用前景。

1971年，我國(guó)從羅馬尼亞引進(jìn)了以‘洛夫林’為代表的小麥－黑麥的1BL／1RS易位系新種質(zhì)，當(dāng)時(shí)因其綜合性狀較好能抗3種銹病和白粉病，被育種家廣泛利用，選育出一大批新品種，導(dǎo)致目前我國(guó)小麥品種中含有Lr26和Yr9的頻率很高。周陽(yáng)等報(bào)道［23］，北 方 冬 麥 區(qū) 1BL／1RS 易 位 系 出 現(xiàn) 頻 率 為59%，黃淮冬麥區(qū)頻率42%。在供試的116個(gè)品種中，利用分子標(biāo)記檢測(cè)出47個(gè)品種中含有Lr26（40．5%），與利用Yr 9進(jìn)行分子檢測(cè)結(jié)果一致（文章未發(fā)表）。在利用28個(gè)具有不同毒性（組合）的小麥葉銹菌單孢分離物對(duì)所供試品種進(jìn)行基因推導(dǎo)時(shí)，推導(dǎo)出43個(gè)品種含有Lr26，與分子檢測(cè)結(jié)果一致，其中‘綿陽(yáng)28’（L16）、‘小偃22’（L18）、‘高優(yōu)503’（L37）和‘徐麥29’（L79）雖PCR檢測(cè)含有Lr26，但未推導(dǎo)出其含有Lr26，可能不同菌系的鑒別力會(huì)受到環(huán)境條件的微觀作用，這4個(gè)品種中也可能存在對(duì)Lr26的抑制基因；或者發(fā)生了遺傳重組；或者1B／1R代換系或易位系存在有抗病基因Lr26丟失的情況。對(duì)小麥抗葉銹病基因Lr26的抑制性尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)系譜分析，‘衡5229’（L61）、‘泛麥5號(hào)’（L71）和‘衡 7228’（L80）的 Lr26 可能源于‘冀5418’［25－26］；‘百 農(nóng) AK58’（L72）和 ‘04 中 3604’（L115）的Lr26 可能源于‘周麥11’［26－27］；‘石4185’（L4）、‘京東8號(hào)’（L20）、‘淮麥20’（L23）、‘魯麥1號(hào)’（L34）、‘陜229’（L35）、‘GS鄭麥004’（L56）、‘河?xùn)| TX－006’（L81）和‘A3－5（L101）’的Lr26 分別來(lái)自‘洛夫林10’、‘洛夫林13’、‘山前麥’和‘牛朱特’等?！?185’（L4）、‘邯6172’（L45）、‘周麥16’（L45）、‘周麥18’（L70）、‘百農(nóng) AK58’（L72）和‘蘭天14’（L85）這6個(gè)品種含有Lr26 與 Li［27］推導(dǎo)出的結(jié)果一致。

通過(guò)分子檢測(cè)‘中梁26’可能含有抗葉銹基因Lr19，‘中梁26’在苗期對(duì)所有測(cè)試的28個(gè)小麥葉銹菌致病類(lèi)型均表現(xiàn)高抗，其親本組合中，‘Ciemenp’抗條銹、葉銹和稈銹，且抗白粉［28］，而‘8 W5015’為抗條銹品種，其他材料均不抗?。ㄋ谓s，私人交流），因此Lr19基因可能來(lái)自于‘Ciemenp’。

關(guān)于Lr9的STS標(biāo)記，已發(fā)表文獻(xiàn)中有兩種觀點(diǎn)，一種是其可擴(kuò)增出1 000 bp，如本研究Lr9 STS標(biāo)記可從近等基因系Tc Lr 9擴(kuò)增出1 000 bp DNA條帶，與劉志勇等［29］和 Urbanovich等［30］報(bào)道片段大小相同；而另一種觀點(diǎn)認(rèn)為可擴(kuò)增出1 100 bp特異性DNA條帶，如Schacher mayr等［9］和 Tyryshkin 等［31］，圖中雖可明確其大小與其他泳道中擴(kuò)增的條帶如Lr25有所不同，但仍需測(cè)序明確其準(zhǔn)確數(shù)值。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建的2個(gè)多重PCR體系穩(wěn)定、可靠，能方便、準(zhǔn)確地應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。任何育種目標(biāo)都不僅僅是對(duì)單一性狀的篩選，如果同時(shí)利用多種性狀的分子標(biāo)記輔助育種，如抗病基因和品質(zhì)基因的分子標(biāo)記輔助選擇，可加快育種進(jìn)程、縮短育種年限，提高效率，同時(shí)降低DNA提取的成本和工作量，從而使分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）真正成為一種快速、有效、經(jīng)濟(jì)的育種方法。

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