孫召朋， 張正坤， 徐文靜， 汪洋洲， 潘洪玉， 李啟云＊

（1．吉林大學(xué)，長春 130062； 2．吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長春 130033）

白僵菌（Beauveria bassiana）是目前國內(nèi)生物防治中應(yīng)用最廣泛的昆蟲病原真菌［1］，具有防治害蟲效果好，不傷害天敵，對人、畜、植物無毒害，容易大量生產(chǎn)，無殘毒，害蟲不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點［2］，在玉米螟和松毛蟲等的防治中已取得很好的防效［3］。研究表明，在穿透寄主體壁的過程中，球孢白僵菌會產(chǎn)生多種降解酶。在穿透昆蟲體壁的早期，昆蟲病原真菌高水平表達蛋白酶，降解昆蟲的體表蛋白［4］。同時，也表達用于降解昆蟲體壁的主要組成成分幾丁質(zhì)的幾丁質(zhì)酶［5］。球孢白僵菌在防治應(yīng)用中菌種資源主要來源于自然直接篩選的菌株，生產(chǎn)的菌株“退化”是防效不穩(wěn)定的重要原因之一。高毒力菌株經(jīng)多代培養(yǎng)后毒力退化的現(xiàn)象已被認(rèn)識［6］，但原因不是十分清楚。本研究對兩株田間采集分離的野生白僵菌菌株進行了培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，通過對亞洲玉米螟的室內(nèi)毒力測定，評價了繼代培養(yǎng)對白僵菌毒力的影響。同時，明確了每一世代白僵菌蛋白酶和幾丁質(zhì)酶基因的表達水平，分析了繼代培養(yǎng)對白僵菌毒力及其蛋白酶和幾丁質(zhì)酶基因的影響。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

供試?yán)ハx：亞洲玉米螟公主嶺種群［Ostrinia f ur nacalis（Guenée）］2齡幼蟲，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所汪洋洲博士提供。

供試菌株：球孢白僵菌D1－5和D6－2分離自德惠市玉米田的玉米螟僵蟲蟲體，由本實驗室沙土管保存于－80℃超低溫冰箱（Ther mo For ma）。

1．2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶Eco RⅠ、Hin dⅢ購自MBI Fer mentas，Trizol reagent購自上海生工，瓊脂糖為Bio－Rad公司產(chǎn)品，總RNA抽提試劑盒為大連寶生物工程有限公司（Ta Ka Ra）產(chǎn)品。所用無水乙醇、異丙醇、氯仿等有機溶劑為中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品，均為分析純。

1．3 室內(nèi)毒力測定

1．3．1 白僵菌供試菌株的繼代培養(yǎng)

將供試菌株在無菌條件下從沙土管接種在SDAY培養(yǎng)基（質(zhì)量濃度4%）葡萄糖，1%蛋白胨，2%酵母膏，p H7．0），為F1代，培養(yǎng)20 d左右后刮取孢子，將孢子制備成1×107個／mL濃度的孢子懸液，涂布于SDAY培養(yǎng)基，共進行F2～F5代培養(yǎng)，每個菌株各世代培養(yǎng)10皿，收集每個世代孢子，均配制成1×107孢子／mL濃度的孢子懸浮液供試。

1．3．2 萌發(fā)率的測定

取相同量菌懸液接種于SDAY培養(yǎng)基中（終濃度為1×105孢子／mL），26℃培養(yǎng)16 h，測其萌發(fā)率，每個菌株重復(fù)3次。

1．3．3 室內(nèi)生物測定方法

將室內(nèi)飼養(yǎng)、齡期一致的2齡玉米螟幼蟲浸入1×107孢子／mL的孢子懸液中5～10 s后，用濾紙吸去多余藥液，將試蟲轉(zhuǎn)移到正常條件下飼養(yǎng)。每處理4次重復(fù)，每重復(fù)浸蟲20頭，并設(shè)無菌水處理作為對照。在黑暗環(huán)境下培養(yǎng)10 d，每天記錄被白僵菌感染的試蟲數(shù)。

1．3．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，計算各處理的校正死亡率，公式如下：

死亡率（P1）＝死亡蟲數(shù)（K）／處理總蟲數(shù)（N）×100%；

校正死亡率（P2）＝［處理死亡率（Pt）－空白對照死亡率（P0）］／［1－空白對照死亡率（P0）］；

利用DPS分析軟件進行統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

1．4 半定量RT－PCR檢測繼代培養(yǎng)對白僵菌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶基因表達的影響

1．4．2 樣品收集及總RNA提取

從培養(yǎng)供試菌株的PDA培養(yǎng)基上刮取100 mg分生孢子，采用Trizol法提取總RNA。利用紫外分光光度計測定各處理中總RNA的濃度，并保證A260／A280比值在 1．8～2．0之間，以確?？?RNA純度。

1．4．2 半定量 RT－PCR［7－11］

利用紫外分光光度計測定樣品RNA濃度，每個處理上樣量為50 ng總RNA，利用蛋白酶（cdep1）（AY040532．1）、幾丁質(zhì)酶（chit1）（AY145－440．1）及管家基因18S r DNA（GQ302680．1）特異性引物進行c DNA第1鏈合成。以各基因c DNA第1鏈為模板進行目的片段PCR，反應(yīng)中調(diào)整反應(yīng)循環(huán)數(shù)，以10、15、20個循環(huán)每隔5個循環(huán)進行一次反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為以目的基因條帶指數(shù)增長期循環(huán)數(shù)為準(zhǔn)確定基因表達量的差異。各基因PCR反應(yīng)體系為：2μL c DNA產(chǎn)物，0．5μL Taq DNA聚合酶，目的基因（或18Sr DNA基因）上下游引物各1μL，d NTPs 1μL，10×buffer 5μL，Mg Cl2（25 mmol／L）3μL，終體積50μL。反應(yīng)程序如下：94℃2 min，94℃50 s，58℃（cdep1）／52 ℃ （chit1）／58 ℃（18S r DNA）50 s，72 ℃ 1 min （10、15、20、25個循環(huán)），72℃10 min。4℃保存。

表1 待測基因所用引物序列

根據(jù)上述PCR反應(yīng)結(jié)果確定各基因擴增指數(shù)期循環(huán)數(shù)，以供試菌株不同世代各基因c DNA為模板，進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳膠濃度1．5%。

2 結(jié)果與分析

2．1 繼代培養(yǎng)對白僵菌孢子萌發(fā)率的影響

兩菌株在SDAY培養(yǎng)基中經(jīng)16 h培養(yǎng)后，其萌發(fā)率如圖1所示。兩個菌株的萌發(fā)率變化規(guī)律基本相似，F(xiàn)2代萌發(fā)率明顯高于F1代，分別達到77%和70%，在隨后的繼代培養(yǎng)中，F(xiàn)3、F4、F5代萌發(fā)率依次降低，L1－1的F5代萌發(fā)率僅為2%。

圖1 供試白僵菌菌株不同世代萌發(fā)率測定（p＝0．05）

2．2 繼代培養(yǎng)對白僵菌殺玉米螟毒力的影響

白僵菌兩菌株不同世代對亞洲玉米螟2齡幼蟲的毒力測定結(jié)果見表2和表3。菌株L1－1 F1代孢子對亞洲玉米螟的致死中時（LT50）和致死90%時間（LT90）分別為186．63 h和284．16 h，而F2代孢子分別為180．61 h和209．61 h，明顯低于F 1代，而F3～F5代孢子的LT50和LT90逐漸增加，明顯高于F2代和F1代，說明其毒力在不斷下降。D6－2菌株F1代孢子對亞洲玉米螟的LT50和LT90分別為170．09 h和190．21 h，而 F2代分別為137．70 h和165．84 h，明顯低于F1代，而F3～F5代孢子的LT50和LT90逐漸增加，明顯高于F2代和F1代，說明隨著繼代次數(shù)的增加其毒力也在不斷下降。

表2 白僵菌L1－1菌株不同世代對亞洲玉米螟2齡幼蟲的毒力（10 7孢子／mL）

表3 白僵菌D6－2菌株不同世代對亞洲玉米螟2齡幼蟲的毒力（10 7孢子／mL）

2．3 繼代培養(yǎng)對白僵菌毒力相關(guān)基因表達的影響

2．3．1 RT－PCR 反應(yīng)循環(huán)數(shù)的確定

利用供試菌株目的基因和管家基因c DNA第1鏈為模板，進行目的基因半定量RT－PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的確定。從圖2中可以看出，18S r DNA基因和chit 1基因在15～20個循環(huán)時條帶差異明顯，而cdep 1基因在10～15個循環(huán)時條帶差異明顯，因此，以18個循環(huán)為18S r DNA基因和chit 1基因的檢測循環(huán)數(shù)，以13個循環(huán)作為cdep1基因的檢測循環(huán)數(shù)。

圖2 管家基因及毒力相關(guān)基因半定量RT－PCR循環(huán)數(shù)的確定

2．3．2 目的基因的半定量RT－PCR檢測

為了明確繼代培養(yǎng)對球孢白僵菌毒力相關(guān)酶基因表達情況的影響，以18Sr DNA基因為內(nèi)參，利用半定量RT－PCR對cdep 1基因和chit 1基因的表達情況進行了檢測。從圖3可以看出，在內(nèi)參基因穩(wěn)定表達，也就是總RNA量相同的情況下，兩個供試菌株L1－1和D6－2的cdep 1基因和chit1基因在F 1和F2代表達穩(wěn)定，隨著繼代次數(shù)的增多，供試菌株兩個基因的PCR條帶明顯變?nèi)酰f明其表達量在不斷下降，這與對亞洲玉米螟毒力測試的結(jié)果一致。

圖3 繼代培養(yǎng)對球孢白僵菌毒力相關(guān)酶基因cdep1和chit1基因mRNA表達的影響

3 討論

毒力測定結(jié)果表明，兩株白僵菌供試菌株的F2代比F1代對亞洲玉米螟2齡幼蟲的毒力有所增強，而F3～F5代對玉米螟的毒力呈下降趨勢。球孢白僵菌通過分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂酶來降解昆蟲體壁，其中幾丁質(zhì)酶和蛋白酶具有重要作用［12－14］。本研究利用半定量RT－PCR方法對兩株白僵菌中兩種毒力相關(guān)酶基因在不同世代的表達情況進行了測定，發(fā)現(xiàn)隨著繼代次數(shù)的增多，供試菌株兩個毒力相關(guān)酶基因的表達量均呈下降趨勢，與對亞洲玉米螟毒力測定結(jié)果一致。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于F1代直接接種于沙土管，菌株并沒有表現(xiàn)出很高的萌發(fā)率和毒力，在F1活化之后，F(xiàn)2代達到其毒力最大值，F(xiàn)3～F5依次減弱。

在白僵菌繼代培養(yǎng)過程中，隨著繼代次數(shù)的增多，會有多個生物性狀發(fā)生改變。P．Rajanikant h等［15］報道繼代培養(yǎng)對產(chǎn)孢量和毒力有很大的影響。唐曉慶等［6］報道了繼代培養(yǎng)中菌落都會發(fā)生變化，并提出了菌落局變發(fā)生的幾種可能的遺傳機制。唐曉慶等人［16］報道了繼代培養(yǎng)對抗旱力的影響，結(jié)果顯示繼代培養(yǎng)能增強菌株的抗旱力，但菌株生活力減弱。樊美珍等［17］通過研究證明，以SDAY為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的不同C／N比、不同p H培養(yǎng)基中，均未發(fā)現(xiàn)菌落局變及菌種退化，SDAY最適于白僵菌生長。本試驗中采用SDAY為培養(yǎng)基研究供試白僵菌菌株萌發(fā)率、毒力及其相關(guān)酶基因的表達，結(jié)果表明這些指標(biāo)均發(fā)生了變化，并且表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。F1與F2代各項指標(biāo)基本相似或者略低于F 2代，從F2代開始到F5代，萌發(fā)率、毒力及其相關(guān)酶基因的表達呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，這和唐曉慶等人所報道的繼代培養(yǎng)中產(chǎn)生不同類型的分離株，這些分離株多表現(xiàn)為產(chǎn)孢量下降、毒力降低等與生產(chǎn)性狀退化類似的變異現(xiàn)象基本相符［18］。其可能的原因是由于F1剛從沙土管中接出，菌株新陳代謝能力下降，經(jīng)過相當(dāng)于活化階段的F1代后，在F2代各種指標(biāo)都達到最大值，從F2代到F5代的繼代培養(yǎng)，菌株毒力相關(guān)酶基因表達量逐漸降低，從而導(dǎo)致了毒力的下降。Ansari等［19］對另一廣泛應(yīng)用的生防真菌綠僵菌（Metar hiziu m anisopliae）的3株商業(yè)化菌株進行了12代的繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其毒力并未發(fā)生變化，并將其作為綠僵菌高效菌株的篩選標(biāo)準(zhǔn)。生防真菌的毒力在繼代培養(yǎng)過程中可能依賴其自身的遺傳背景，本研究中只對兩株白僵菌菌株進行了繼代培養(yǎng)對毒力及毒力相關(guān)因素的影響，是否在白僵菌中存在經(jīng)繼代培養(yǎng)而毒力不發(fā)生變化的菌株，還需要進一步研究。

由于白僵菌對靶標(biāo)昆蟲的致病力由多種因素造成［6］，本研究只是從蛋白酶和幾丁質(zhì)酶基因的表達方面進行了研究，關(guān)于其他影響因素如萌發(fā)率、毒素代謝水平等還需進一步研究。同時，在菌種使用過程中，定期進行蟲體復(fù)壯，可以恢復(fù)菌株毒力這一問題上存在爭論［20］，本試驗只對培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)白僵菌毒力退化情況進行了測定，對于通過蟲體進行菌株復(fù)壯并未研究，后者可作為以后研究的新方向。

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