麻耀華， 尹淑麗， 張麗萍＊， 黃亞麗， 張 蕾

（1．河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081； 2．河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050016）

黃瓜是我國(guó)的主栽蔬菜之一，多年連作使得尖孢鐮刀菌在土壤中大量積累，引起黃瓜枯萎病的暴發(fā)，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為影響設(shè)施黃瓜高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙。目前，主要以殺菌廣、見(jiàn)效快的化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，由于病原菌易產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致化學(xué)農(nóng)藥施用量不斷增加，造成了嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留及土壤生物結(jié)構(gòu)的破壞［1］。因此，相對(duì)安全的生物防治引起了人們的關(guān)注。劉敏等人研究的采用擬康氏木霉和枯草芽胞桿菌對(duì)黃瓜枯萎病具有協(xié)同防治作用［3］；陳雪麗、王光華等人接種2株生防菌對(duì)大豆根腐病、黃瓜和番茄枯萎病具有一定的防治效果，且具有較明顯的促生作用［3－4］。土壤微生物數(shù)量是標(biāo)志土壤生物學(xué)性質(zhì)的重要組成部分。王茹華等人通過(guò)試驗(yàn)證明植物對(duì)土傳病害的抗性與根際土壤微生物關(guān)系密切［5］。目前，復(fù)合微生態(tài)制劑的研究主要集中在兩種微生物構(gòu)成的復(fù)合微生態(tài)制劑應(yīng)用效果及其生態(tài)效應(yīng)上，多種復(fù)合的微生態(tài)制劑對(duì)植物微生態(tài)環(huán)境、土壤酶活的影響及其與病害防治間關(guān)系的系統(tǒng)研究少見(jiàn)報(bào)道。本項(xiàng)目組研制出了防治黃瓜等多種植物土傳真菌病害的復(fù)合微生態(tài)制劑，并取得了農(nóng)業(yè)部施肥登記證。本研究采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)及土壤酶活測(cè)定方法，探討于黃瓜不同生育時(shí)期施用復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤根際微生物數(shù)量和土壤酶活性的影響，為明確復(fù)合微生態(tài)制劑防治黃瓜枯萎病的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

供試黃瓜種子先用復(fù)合微生態(tài)制劑浸泡4 h后，于花盆（26 c m×26 c m）內(nèi)種植黃瓜，供試土為大棚中7年連作黃瓜土壤，其中加入10%蛭石混勻。

供試 土 壤特 性：p H 為6．78，有 機(jī) 質(zhì)含 量4．186%，全氮0．285%，速效磷1 239．46 mg／kg，速效鉀444．60 mg／kg。

1．1．2 復(fù)合微生態(tài)制劑

該菌劑為主要由枯草芽胞桿菌BSD－2、放線(xiàn)菌S－317、木霉T36等多種有益微生物構(gòu)成的液態(tài)復(fù)合微生態(tài)制劑，活菌含量為1×108cf u／mL。

1．1．3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，在黃瓜苗期（6月11日）、花期（7月1日）、瓜期（7月22日）分別施入復(fù)合微生態(tài)制劑，每盆加入1×108cf u／mL復(fù)合微生態(tài)制劑20 mL，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以不施入復(fù)合微生態(tài)制劑為對(duì)照CK（5月30日）。在拉秧期分別取4個(gè)時(shí)期處理的黃瓜根際土壤，測(cè)定土壤微生物數(shù)量和土壤酶活。

1．2 測(cè)定方法

1．2．1 土壤微生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)

測(cè)定土壤細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌、尖孢鐮刀菌數(shù)量，微生物計(jì)數(shù)采用傳統(tǒng)方法［6］，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線(xiàn)菌采用改良髙氏1號(hào)培養(yǎng)基，真菌采用PDA培養(yǎng)基，尖孢鐮刀菌采用選擇性培養(yǎng)基（參照 Komada H 的方法）［7］。

1．2．2 土壤酶活的測(cè)定

測(cè)定土壤中脲酶、過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性。土壤脲酶活性用靛酚藍(lán)比色法［8］測(cè)定，以每克土24 h產(chǎn)生的NH3－N毫克數(shù)表示；過(guò)氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法［8］測(cè)定，以每克土消耗0．1 mol／L K Mn O4毫升數(shù)表示；蔗糖酶活性用3，5－二硝基水楊酸比色法［8］測(cè)定，以每克土24 h產(chǎn)生的葡萄糖毫克數(shù)表示；中性磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法［9］測(cè)定，以每克土24 h產(chǎn)生的酚毫克數(shù)表示。

1．3 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，用DPS進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同生育期加入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)黃瓜根際土壤微生物數(shù)量的影響

由圖1、圖2試驗(yàn)結(jié)果可知，不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑，苗期、花期、瓜期施入處理與對(duì)照相比，細(xì)菌數(shù)量分別增長(zhǎng)了3．8%、27．9%、12．2%；放線(xiàn)菌數(shù)量分別增長(zhǎng)了12．6%、20．6%、9．7%。花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑處理對(duì)根際土壤中細(xì)菌和放線(xiàn)菌數(shù)量的影響最大，可能是由于施入復(fù)合微生態(tài)制劑后土壤中細(xì)菌和放線(xiàn)菌的積累促進(jìn)了黃瓜植株的旺盛生長(zhǎng)，增加了根系及根系分泌物，從而使微生物生命活動(dòng)旺盛；在苗期、花期和瓜期施入復(fù)合微生態(tài)制劑，與對(duì)照相比，土壤中細(xì)菌和放線(xiàn)菌數(shù)量有顯著差異。復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤中細(xì)菌和放線(xiàn)菌數(shù)量有促進(jìn)作用，其中在花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)根際土壤中細(xì)菌和放線(xiàn)菌數(shù)量的影響最大。

圖1 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)黃瓜根際土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

圖2 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)黃瓜根際土壤放線(xiàn)菌數(shù)量的影響

在花期、瓜期施入復(fù)合微生態(tài)制劑的處理，土壤微生物真菌數(shù)量分別比對(duì)照減少了64．5%、17．7%，與對(duì)照相比差異顯著；苗期施入處理與對(duì)照相比差異不顯著；苗期、花期與瓜期處理尖孢鐮刀菌數(shù)量分別比對(duì)照減少了7．6%、66．7%、51．8%，各處理與對(duì)照相比差異性均顯著（圖3、圖4）。由此看出，復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤真菌和尖孢鐮刀菌都表現(xiàn)為抑制作用，其中花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑的處理對(duì)真菌及尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響最大。

圖3 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)黃瓜根際土壤真菌數(shù)量的影響

從整個(gè)生育期來(lái)看，在花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑后，黃瓜根際土壤微生物細(xì)菌和放線(xiàn)菌數(shù)量顯著高于對(duì)照，細(xì)菌增加了27．9%，放線(xiàn)菌增加了20．6%；真菌和尖孢鐮刀菌的數(shù)量顯著低于對(duì)照，真菌減少了64．5%，尖孢鐮刀菌減少了66．7%，說(shuō)明復(fù)合微生態(tài)制劑的施入能夠抑制真菌和尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)。

圖4 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)黃瓜根際土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

2．2 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)不同生育期黃瓜根際土壤酶活性的影響

2．2．1 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤脲酶活性的影響

脲酶廣泛存在于土壤中，對(duì)尿素在土壤中的轉(zhuǎn)化及尿素利用率有重大影響［10］。苗期、花期、瓜期施入處理與對(duì)照相比，脲酶活性分別增加了70．6%、130．8%、110．96%，其中在花期處理脲酶活性最高（圖5），表明花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑可顯著提高土壤脲酶活性。

圖5 不同生育時(shí)期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤脲酶活性的影響

2．2．2 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶活性的影響

過(guò)氧化氫酶是一種分解土壤中過(guò)氧化氫進(jìn)而減小其對(duì)植物毒害作用的氧化還原酶，可以用來(lái)表征土壤的生化活性［11－12］。由圖6可知，苗期、花期、瓜期施菌處理土壤過(guò)氧化氫酶活性與對(duì)照相比差異顯著，均可提高過(guò)氧化氫酶活性，但3個(gè)處理間無(wú)顯著差異。土壤過(guò)氧化氫酶活性變化較小，表明不同生育時(shí)期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)根際土壤中過(guò)氧化氫酶活性的影響不明顯。

圖6 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶活性的影響

2．2．3 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤蔗糖酶活性的影響

土壤蔗糖酶是表征土壤生物學(xué)活性的重要酶，蔗糖酶活性高，說(shuō)明土壤生物活性高，土壤狀況良好［13－14］。3種處理的土壤蔗糖酶活性均高于對(duì)照，差異均顯著。花期、瓜期施入處理與對(duì)照相比，蔗糖酶活性分別增加了190．5%、206．3%（圖7）。不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑與對(duì)照相比，均可以提高根際土壤中蔗糖酶活性。

圖7 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤蔗糖酶活性的影響

2．2．4 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤中性磷酸酶活性的影響

土壤磷酸酶是催化土壤中磷酸單酯和磷酸二酯水解的酶，它能將有機(jī)磷酯水解為無(wú)機(jī)磷酸［15］。在整個(gè)生育期中，各處理土壤中性磷酸酶活性均高于對(duì)照，花期和瓜期施菌處理土壤中性磷酸酶活性變化較大，與對(duì)照相比，分別增加了123．5%和117．6%；而苗期施用變化相對(duì)較小，與對(duì)照比增加了52．9%（圖8），3個(gè)處理與對(duì)照相比，差異均顯著。因此，不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑與對(duì)照相比，均可以提高根際土壤中性磷酸酶活性。

圖8 不同生育期施入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)土壤中性磷酸酶活性的影響

3 討論

3．1 不同生育期加入復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)黃瓜根際土壤微生物數(shù)量的影響

復(fù)合微生態(tài)制劑促進(jìn)了土壤微生物中細(xì)菌和放線(xiàn)菌的增殖，抑制了真菌和尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)。與不施入菌劑對(duì)照相比，在花期施菌處理，細(xì)菌增加27．9%，放線(xiàn)菌增加20．6%，真菌減少64．5%，尖孢鐮刀菌減少66．7%。從本試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，施入復(fù)合微生態(tài)制劑后，真菌和尖孢鐮刀菌數(shù)量明顯受到抑制，細(xì)菌和放線(xiàn)菌數(shù)量明顯提高，說(shuō)明可能是由于復(fù)合微生態(tài)制劑的施入促進(jìn)了根際土壤細(xì)菌和放線(xiàn)菌等微生物的大量繁殖，從而抑制了真菌和尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，減少黃瓜枯萎病發(fā)生的可能性。復(fù)合微生態(tài)制劑的施入可以影響根際土壤中微生物的數(shù)量，從而可以達(dá)到改善土壤結(jié)構(gòu)的作用。而土壤微生物是土壤酶重要來(lái)源之一，土壤微生物的增加，有利于提高土壤酶的活性［16］。這一結(jié)果與苗則彥［17］等人在研究不同抗、感枯萎病黃瓜品種不同生育期根際微生物數(shù)量消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析所得的結(jié)論相似，即根際細(xì)菌數(shù)量在花期處理達(dá)到最高。細(xì)菌和放線(xiàn)菌大量增殖，其分泌抗生素等物質(zhì)對(duì)真菌有拮抗作用［18］。之后隨著復(fù)合微生態(tài)制劑的降解，到末期細(xì)菌和放線(xiàn)菌的生長(zhǎng)繁殖受到抑制，對(duì)真菌的拮抗作用逐漸減弱，真菌數(shù)量又呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3．2 復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)不同生育期黃瓜根際土壤酶活性的影響

酶類(lèi)參與了土壤中一切復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程，包括凋落物的分解，腐殖質(zhì)及各種有機(jī)化合物的分解與合成，土壤養(yǎng)分固定與釋放，以及各種氧化還原反應(yīng)，直接參與了土壤營(yíng)養(yǎng)元素的有效化過(guò)程。土壤酶活性是土壤生物活性較為穩(wěn)定和靈敏的一個(gè)指標(biāo)，在一定程度上能夠反映土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化動(dòng)態(tài)［19］。根際土壤酶是土壤中具有生物活性的蛋白質(zhì)，是由微生物、動(dòng)植物活體的分泌物或動(dòng)植物殘?bào)w、遺骸分解釋放于土壤中的一類(lèi)具有催化能力的生物活性物質(zhì)，其活性是土壤新陳代謝的重要肥力指標(biāo)［20－22］。土壤酶活性增強(qiáng)意味著土壤生物活性提高，能增強(qiáng)植株的抗性［20］。其中，脲酶是一種專(zhuān)屬性很強(qiáng)的水解酶，能催化酰胺化合物水解為氨，根際土壤中脲酶活性的提高，將加速土壤的各類(lèi)含氮有機(jī)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為植物可利用的物質(zhì)，從而提高根系有效態(tài)氮的含量。磷酸酶活性的增加可加速土壤有機(jī)磷脫磷速度，改善土壤磷素的供應(yīng)水平，磷酸酶能促進(jìn)土壤中有機(jī)磷化合物或無(wú)機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化成能為黃瓜利用的無(wú)機(jī)態(tài)磷。黃瓜根際土壤中蔗糖酶活性的增加為根際微環(huán)境提供了必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。過(guò)氧化氫酶可促進(jìn)土壤多種化合物的氧化，并可防止過(guò)氧化氫積累對(duì)生物體造成毒害。本研究結(jié)果表明復(fù)合微生態(tài)制劑的施入能夠提高土壤中脲酶、中性磷酸酶和蔗糖酶的生物活性，改善根際土壤環(huán)境，促進(jìn)微生物繁衍并延緩?fù)寥牢⑸锼p的速率，有利于實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)的目標(biāo)。

與對(duì)照相比，花期施入復(fù)合微生態(tài)制劑后，促進(jìn)了根際土壤中細(xì)菌和放線(xiàn)菌的生長(zhǎng)，抑制了真菌和尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)，提高了根際土壤中脲酶、過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶、中性磷酸酶的活性，促進(jìn)了花期土壤中微生物種類(lèi)和數(shù)量到拉秧期可持續(xù)達(dá)到最大保護(hù)值，為黃瓜根際土壤創(chuàng)造了良好的微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而為黃瓜的快速生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。土壤微生物活性提高，可能會(huì)增強(qiáng)與其土壤病原菌之間在空間及養(yǎng)分上的競(jìng)爭(zhēng)，減輕病害的發(fā)生。但復(fù)合微生態(tài)制劑生防機(jī)理研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠深入和細(xì)致，很多方面有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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