周濤，朱雄軍，蘇建華，姚冬生，劉大嶺

1 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物技術(shù)研究所，廣東 廣州 510632

2 廣東省生物工程藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632

葡萄糖氧化酶 (Glucose oxidase，GOD) 屬于氧化還原酶類 (EC 1.1.3.4)，能專一性地將β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和過氧化氫，廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物體內(nèi)。該酶在食品、飲品發(fā)酵、飼料工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。

酶是一類重要的高效生物催化劑，但是由于酶的不穩(wěn)定性問題使其在工業(yè)應(yīng)用和商業(yè)生產(chǎn)中受到限制。因此，眾多學(xué)者嘗試用固定化和化學(xué)修飾[1-2]的方法來提高酶的穩(wěn)定性，其中共價(jià)結(jié)合法是目前研究最多的固定化方法之一[3]。固定化酶與載體結(jié)合牢固，即使在高底物濃度和高離子強(qiáng)度情況下，也不會(huì)導(dǎo)致酶與載體解離，因而具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性[4]，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)、食品衛(wèi)生和輕紡化工等各個(gè)領(lǐng)域。但是，由于共價(jià)結(jié)合反應(yīng)劇烈，酶在固定化過程中活性中心或者變構(gòu)中心的構(gòu)象發(fā)生不可逆的變化，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合能力及活性下降，一定程度上限制了酶的共價(jià)固定化技術(shù)的應(yīng)用。

本文嘗試?yán)玫鞍踪|(zhì)在有機(jī)溶劑中的“剛硬”特點(diǎn)，在有機(jī)相中對(duì)GOD進(jìn)行共價(jià)固定化，考察有機(jī)相環(huán)境幫助GOD克服共價(jià)固定化過程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)引起的構(gòu)象變化而導(dǎo)致酶失活的現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖氧化酶：(EC 1.1.3.4, 5.6 U/mg，Sigma-Aldrich)；85%~90%脫乙酰度的殼聚糖、25%戊二醛溶液、冰乙酸、氫氧化鈉、乙醇、1,4-二氧六環(huán)、乙醚等均為國產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1900雙光束紫外可見光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PFDS8508型冷凍干燥機(jī)：韓國浩瀚有限公司；PB-10 pH計(jì)：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；超純水系統(tǒng)：Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 GOD在最適pH緩沖液中凍干預(yù)處理

將GOD溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 6.0)中制成10 mg/mL的酶液，冷凍干燥后備用。

1.3.2 殼聚糖微球的制備及活化

稱取3 g殼聚糖粉末加入99 mL蒸餾水中，攪拌10 min，加入1 mL冰乙酸，室溫下攪拌混合3 h，紗布過濾，制得濃度3% (W/V) 的殼聚糖溶液。將殼聚糖溶液注入含有 10%NaOH (W/V) 和 16.67%的 95%乙醇 (V/V) 的凝結(jié)液中，制成直徑約2 mm的殼聚糖微球，蒸餾水沖洗至中性。按戊二醛溶液/殼聚糖微球 10 mL/g的比例混合加入對(duì)應(yīng)一定濃度的戊二醛水溶液，活化2 h后洗至中性，充分干燥備用。

1.3.3 固定化GOD的制備

有機(jī)相固定化 GOD：微量水溶解凍干的GOD(水分比例：0.4%~ 1.8%)，加入適量已活化的殼聚糖微球和預(yù)先干燥的有機(jī)溶劑，冰上震蕩共價(jià)交聯(lián)2 h后放入4 ℃冰箱過夜。用pH 6.0，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗掉未交聯(lián)的GOD，過濾干燥。

水相固定化GOD：取10 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 6.0) 溶解凍干的GOD，加入一定量已活化的殼聚糖微球，冰上震蕩活化2 h后放入4 ℃冰箱過夜。過濾，洗掉載體表面未交聯(lián)的GOD，干燥備用。

1.3.4 GOD酶活力的測定[5]

定義一個(gè)GOD酶活力單位相當(dāng)于在規(guī)定條件下，于溫度25 ℃、pH 6.0，每分鐘分解1 μmol鄰-聯(lián)二茴香胺時(shí)所需的酶量。固定化酶測活過程改進(jìn)為將2.6 mL鄰-聯(lián)二茴香胺緩沖混合液、0.30 mL底物溶液和0.10 mL過氧化物酶溶液滴入1 cm比色皿中，調(diào)整溫度至25 ℃，然后加若干 g固定化 GOD，其他操作同。單位：U/g載體。

1.3.5 GOD的固定化條件的優(yōu)化

戊二醛濃度：使用戊二醛濃度 (0.05%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%) 將GOD固定在殼聚糖微球上，測定固定化酶活；使獲得酶活最佳的戊二醛濃度，嘗試加酶量/載體 (20 mg/1 g、40 mg/1 g、60 mg/1 g、80 mg/1 g和100 mg/1 g)進(jìn)行水相和有機(jī)相固定化，以上述優(yōu)化的戊二醛濃度和加酶量并分別在不同含水量的各種有機(jī)溶劑1,4-二氧六環(huán)、乙醚和乙醇中分別對(duì)GOD進(jìn)行固定化。以各系列實(shí)驗(yàn)中酶活最高者為100%，以相對(duì)酶活和酶比活表示各實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.6 固定化GOD的酶學(xué)性質(zhì)分析

以下實(shí)驗(yàn)均按1.3.5的最佳優(yōu)化條件進(jìn)行有機(jī)相與水相固定化，酶活性測定按照1.3.4方法。

最適反應(yīng)溫度：分別在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃測定固定化GOD的酶活力，以有機(jī)相酶活力最高值為100%，以酶比活力和相對(duì)酶活力來表示不同溫度下固定化酶活性變化情況。

最適反應(yīng)pH：固定化GOD分別在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5下測活。以有機(jī)相酶活力最高值為100%，以酶比活力和相對(duì)酶活力來表示不同pH下固定化酶活性變化情況。

熱穩(wěn)定性：60 ℃水浴孵化固定化GOD，每30 min取樣測定殘留酶活。以未處理前的固定化酶活力最高者為100%，以酶比活力和相對(duì)酶活來表示固定化酶隨熱處理時(shí)間不同的酶活變化情況。

pH穩(wěn)定性：水相和有機(jī)相固定化GOD溶液置于pH 4.0-8.0的緩沖液中4 ℃處理5 h，傾去緩沖液，沖洗數(shù)次，以處理后殘留酶活最高者為100%，以酶比活力和相對(duì)酶活表示固定化GOD酶活對(duì)pH的穩(wěn)定性。

操作穩(wěn)定性：固定化GOD酶活測定一次，傾去反應(yīng)液將固定化酶用pH 6.0，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗固定化酶，洗去表面殘留的未反應(yīng)的底物和反應(yīng)后的產(chǎn)物，重新轉(zhuǎn)入底物溶液測定殘留酶活力，如此反復(fù)操作，考察隨著使用次數(shù)的增加，固定化酶酶活的保留情況。

以上實(shí)驗(yàn)中把各自最高組的酶比活作為100%，以相對(duì)酶活表示不同濃度的戊二醛作為交聯(lián)劑所得固定化酶活性的變化情況。

1.3.7 GOD蛋白固定率和有效酶活回收率的測定

按照Bradford法[6]建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)測定殘液中酶蛋白的濃度。

1.3.8 固定化GOD的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定

分別配制濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L的葡萄糖底物溶液，取0.002 g固定化GOD，按照1.3.4的方法分別測定并計(jì)算每分鐘葡萄糖的分解量，連續(xù)測定5 min。以葡萄糖濃度和GOD分解底物的速度作圖計(jì)算固定化GOD的Kmapp、Vmax、Kcat值。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化GOD條件的優(yōu)化

2.1.1 戊二醛濃度對(duì)固定化GOD酶活的影響

圖1顯示，當(dāng)戊二醛濃度為0.1%時(shí)，GOD的催化活力最高，繼續(xù)增加戊二醛濃度，GOD活下降趨勢明顯。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用最適戊二醛濃度0.1%。

圖1 戊二醛濃度對(duì)固定化GOD活力的影響Fig. 1 Effect of glutaradehyde concentration on the covalently immobilized GOD.

2.1.2 加酶量對(duì)固定化GOD酶活的影響

圖2表明，當(dāng)加酶量在0~80 mg酶/g殼聚糖載體時(shí)，固定化GOD的相對(duì)酶活隨著GOD加入量的增加而增大，當(dāng)加入的酶量為80 mg酶/g殼聚糖時(shí)，固定化GOD的相對(duì)活力最高，固定化效果最好。當(dāng)酶量增至100 mg酶/g殼聚糖載體微球時(shí)，固定化酶的相對(duì)活力有所下降。

2.1.3 有機(jī)溶劑含水量對(duì)固定化 GOD酶活的影響

圖2 加酶量對(duì)固定化GOD酶活力的影響Fig. 2 Effect of dosage on the covalently immobilized GOD activity.

研究發(fā)現(xiàn)，水對(duì)有機(jī)介質(zhì)中酶的催化作用影響巨大，它有利于酶構(gòu)象結(jié)構(gòu)剛性的維持，使其保持較好的催化活性。一方面，酶分子需要維持其分子完整的空間構(gòu)象必需最低水量即必需水，而必需水與酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有密切關(guān)系，不同的酶所需的必需水的含量差別很大；另一方面，水影響酶催化反應(yīng)速度：有機(jī)介質(zhì)中水的含量對(duì)酶催化反應(yīng)速度有顯著影響，在水溶解度范圍內(nèi)酶促反應(yīng)活力隨溶溶劑中水含量的增加而增加[7]。在催化反應(yīng)速度達(dá)到最大的含水量稱為最適含水量，酶的必需含水量主要取決于溶劑而并非酶本身[8]。催化反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量與溶劑的親水性、疏水性密切相關(guān)。Hailing[9]提出水活度 (Thermodynamic activity of water, aw) 描述水對(duì)有機(jī)相中脂酶酶促反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)酶活性的大小依賴于水活度的變化。aw定義為系統(tǒng)中水的逸度與純水的逸度之比，水的逸度在理想條件下用水的蒸汽壓代替，因此aw可以用體系中水的蒸汽壓和同樣條件下純水蒸汽壓之比表示。aw=γwcw，其中γw為活度系數(shù)，cw為水的摩爾比。另外，Bell等[10]發(fā)現(xiàn)，在極性溶劑中，通常難以得到水活度 aw與酶活力的關(guān)系，這可能是由于溶劑對(duì)水的影響大于酶對(duì)水的結(jié)合作用。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際情況，通過實(shí)驗(yàn)確定最適宜的含水量，因此，我們嘗試在有機(jī)溶劑中加入不同比例的微量水，將凍干的葡萄糖氧化酶在這些含有微量水的有機(jī)相中與殼聚糖微球進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。有機(jī)溶劑含水量對(duì)共價(jià)固定化GOD活力的影響見圖3。

圖3表明，分別在含水1.6%的乙醚、含水1.0%的1,4-二氧六環(huán)和乙醇有機(jī)介質(zhì)中，固定化葡萄糖氧化酶的相對(duì)酶活最高。在低于或高于最適含水量的有機(jī)介質(zhì)中固定化酶的相對(duì)酶活均較低，可能是因?yàn)槊附?jīng)過真空干燥后幾乎不含水，當(dāng)加入的水低于該酶分子維持其活性構(gòu)象所必需的最低含水量，這時(shí)酶分子的活性構(gòu)象會(huì)喪失，直接的表象就是酶的活性降低，而當(dāng)酶在高于最適含水量的有機(jī)介質(zhì)中固定化時(shí)，微環(huán)境的改變可能使酶不能完全維持一個(gè)相對(duì)剛性的構(gòu)象，經(jīng)過劇烈的共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)后，部分酶的構(gòu)象發(fā)生不可逆的扭曲，最終這種微觀的構(gòu)象改變就以酶活的下降表現(xiàn)出來。

圖3 有機(jī)溶劑含水量對(duì)固定化GOD酶活力的影響Fig. 3 Effect of water content with organic solvents on the covalently immobilized GOD activity.

2.2 固定化GOD的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1 固定化GOD的最適反應(yīng)溫度

不同介質(zhì)中共價(jià)固定化GOD在不同的反應(yīng)溫度條件酶活測定結(jié)果如圖4所示。

從相對(duì)酶活力來看，圖4中不同有機(jī)相固定的 GOD酶比活力整體上要高于水相固定的GOD。其中，1,4-二氧六環(huán)中固定的 GOD在其最適反應(yīng)溫度條件下酶比活是水相固定的 GOD的4倍，40 ℃時(shí)，1,4-二氧六環(huán)中固定的GOD酶比活力是對(duì)應(yīng)水相固定化 GOD酶比活的 5.6倍?？梢娊?jīng)過一定優(yōu)選后，有機(jī)相中固定的酶比水相固定的酶顯示了更好的耐熱性。從不同有機(jī)相固定化GOD的最適反應(yīng)溫度 (圖4) 來看，各有機(jī)相固定的GOD的最適反應(yīng)溫度相同 (乙醚)或略低于水相中固定的 GOD，產(chǎn)生這種差異的原因有待進(jìn)一步探討。

圖4 固定化GOD的最適反應(yīng)溫度Fig. 4 Optimum temperature on the covalently immobilized GOD.

2.2.2 固定化GOD的最適反應(yīng)pH

不同介質(zhì)中固定化GOD在不同pH條件下催化反應(yīng)GOD酶活測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 固定化GOD的最適反應(yīng)pHFig. 5 Optimun reaction pH on the covalently immobilized GOD.

圖5可看出，在實(shí)驗(yàn)的pH范圍內(nèi)，有機(jī)相和水相固定化的GOD的最適反應(yīng)pH值略有變化，產(chǎn)生pH偏移的原因可能是因?yàn)镚OD催化的產(chǎn)物葡萄糖酸呈酸性，由于其擴(kuò)散受到限制而使葡萄糖酸積累在固定化酶所處的催化區(qū)域內(nèi)，此區(qū)域內(nèi)的pH值降低，為抵御這種影響必須提高溶液的pH，才能使固定化GOD的具有最高的活性，因而導(dǎo)致固定化GOD作用的最適pH值有向堿性方向移動(dòng)的趨勢。但是有機(jī)相固定的GOD都比水相固定的酶表現(xiàn)出更高的比活力，其中在1,4-二氧六環(huán)有機(jī)相中表現(xiàn)最為顯著。在pH 5.5時(shí)，水相固定的GOD僅是1,4-二氧六環(huán)中固定的GOD酶比活的20%。

2.3 有機(jī)相固定化GOD穩(wěn)定性分析

2.3.1 不同有機(jī)相中固定化GOD的熱穩(wěn)定性

對(duì)各有機(jī)介質(zhì)固定化的GOD進(jìn)行熱處理一定時(shí)間，觀察酶活下降情況如圖6所示。

圖6 固定化葡萄糖氧化酶的熱穩(wěn)定性Fig. 6 Thermal stability of covalently immobilized GOD.

三種有機(jī)相中固定的GOD熱處理后,其固定化酶比活力均高于水相固定的該酶，即有機(jī)相固定GOD在熱穩(wěn)定性上比水相固定的GOD表現(xiàn)出優(yōu)勢。雖然這種效應(yīng)在乙醚中固定的GOD上面并不明顯。但從實(shí)際應(yīng)用的角度來講，在高溫下使用酶時(shí)，有機(jī)相固定的酶有可能獲得比傳統(tǒng)的水相下固定的酶有更好的活性表現(xiàn)。但單從熱穩(wěn)定性即熱處理后相對(duì)于該固定化酶熱處理前的活性損失率來講，1,4-二氧六環(huán)有機(jī)相中固定GOD其活力的下降還是比較顯著的，相比較而言，乙醇相固定的GOD的熱處理前后酶活損失較少，但整體上酶的活力仍不及1,4-二氧六環(huán)中固定的 GOD (盡管熱處理使固定酶的酶活損失較為明顯)。

根據(jù)固定化酶半衰期計(jì)算公式：

2.3.2 不同有機(jī)相中固定化GOD的pH穩(wěn)定性

不同pH的緩沖液處理5 h后，固定化GOD

酶活變化情況如圖7所示。

表1 不同介質(zhì)中共價(jià)固定化GOD熱穩(wěn)定性半衰期Table 1 Half-life of immobilized GOD under different media

圖7 共價(jià)固定化GOD的pH穩(wěn)定性Fig. 7 pH stability of covalently immobilized GOD.

由圖7可看出，經(jīng)過不同的酸堿條件處理后，整體上有機(jī)相固定化GOD都仍然能保持比水相固定的GOD更高的酶比活。4種介質(zhì)下固定的GOD對(duì)酸堿的處理酶活變化趨勢都比較平緩，而且1,4-二氧六環(huán)和乙醇中固定的GOD能表現(xiàn)出更明顯的耐受酸堿性優(yōu)勢。

2.3.3 有機(jī)相固定化GOD的操作穩(wěn)定性

在實(shí)際應(yīng)用中酶的重復(fù)使用效率是評(píng)價(jià)固定化酶的重要指標(biāo)之一[11]。有機(jī)相共價(jià)固定的GOD重復(fù)使用多次過程中酶活損失情況如圖8所示。

有機(jī)相共價(jià)固定的酶與傳統(tǒng)的水相共價(jià)固定化GOD整體上沒有太大的改善。但是由于有機(jī)相中共價(jià)固定化GOD有更高的酶比活，雖然重復(fù)使用多次后其殘留比活下降的趨勢與水相固定的酶活力相似，但絕對(duì)的殘留酶比活相比于水相固定的酶仍然具有優(yōu)勢。如使用7次后，乙醚、1,4-二氧六環(huán)和乙醇中固定的GOD殘留相對(duì)酶活分別比水相固定化 GOD高出 27.40%、23.45%、15.76%。這與該酶在三種有機(jī)溶劑的極性相關(guān)。酶分子表面少量的水對(duì)酶保持活性是必需的，不同的有機(jī)溶劑奪取酶必需水的能力不同。要達(dá)到一定的酶活性，不同溶劑所需的水量也不同。關(guān)于有機(jī)溶劑的生物兼容性問題，最終要通過實(shí)驗(yàn)才能確定適于維持酶的最佳活性的有機(jī)溶劑。

圖8 共價(jià)固定化GOD的操作穩(wěn)定性Fig. 8 Operational stability of covalently immobilized GOD.

2.4 GOD的固定率和有效固定化酶比活

由于交聯(lián)到載體上的酶蛋白量和活性會(huì)因?yàn)榻橘|(zhì)的不同而有所差異，干擾了以固定化酶的酶比活來評(píng)估“有機(jī)相對(duì)維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象”的貢獻(xiàn)。所以有必要了解交聯(lián)到載體上的蛋白量和有效固定化酶比活。不同介質(zhì)中固定化酶的有效比活力結(jié)果如表 2 所示。

表2表明，盡管有機(jī)相中蛋白質(zhì)固定率或高或低，但有機(jī)相中固定的酶比活均高于水相中固定化酶的比活?？鄢虻鞍纵d量的差異而引起的比活變化后的蛋白比活即有效固定化酶比活也表明有機(jī)相固定化酶比活均比水相固定化酶高。

2.5 固定化GOD動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

通過雙倒數(shù)方程作圖法求的不同介質(zhì)中固定化GOD的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。表3結(jié)果顯示，GOD經(jīng)過水相和有機(jī)相固定化后，其Kmapp值較游離酶明顯減小，說明固定化 GOD更有利于底物結(jié)合。綜合來看，1,4-二氧六環(huán)有機(jī)相固定化 GOD效果最明顯，其表觀米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率分別為：Kmapp=5.63 mmol/L、Vmax=1.70 μmol/(min·mg protein)，水相固定化GOD的表觀米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率分別為：Kmapp=7.33 mmol/L、Vmax=1.02 μmol/(min·mg protein)。表明 1,4-二氧六環(huán)有機(jī)相固定化 GOD較水相固定化 GOD與底物葡萄糖的親和力增加。這其中受到載體性質(zhì)、固定化方法及固定化酶的應(yīng)用環(huán)境等因素的綜合影響，具體原因有待進(jìn)一步探究;如表3所示，與水相固定化的GOD的轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat為0.221 S-1相比，三種有機(jī)介質(zhì)中固定化的 GOD的轉(zhuǎn)換數(shù)均優(yōu)于水相固定化GOD，其中1,4-二氧六環(huán)有機(jī)相固定化GOD表現(xiàn)最佳，Kcat達(dá)到0.304 S-1。這其中可能是受到固定化酶催化性質(zhì)的其他因素的影響，如空間位阻和擴(kuò)散控制等。

表2 不同介質(zhì)中葡萄糖氧化酶的共價(jià)固定化效果比較Table 2 Comparison of covalently immobilized GOD under different media

表3 不同介質(zhì)中共價(jià)固定化GOD的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of immobilized GOD under different media

近年來關(guān)于GOD的水相共價(jià)固定化研究與本實(shí)驗(yàn)中GOD的有機(jī)相共價(jià)固定化的一些參數(shù)比較見表4。

影響因子 (Effectiveness factors，EF) 是固定化體系的重要的評(píng)價(jià)參數(shù)[16-18]。如果EF＜1，則固定化體系中存在因固定化載體的傳質(zhì)作用而存在底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散阻礙效應(yīng)；若EF≥1，則擴(kuò)散阻礙可以忽略。如表4所示，本研究中GOD在水相、1,4-二氧六環(huán)中以戊二醛活化的殼聚糖上固定化后，固定化酶的Vmax要大于游離酶，不存在底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)和擴(kuò)散的阻礙作用，顯示有機(jī)相中進(jìn)行酶的固定化優(yōu)勢所在。這種現(xiàn)象和已報(bào)道的 GOD在水相中固定化的結(jié)果有所不同，具體原因有待考察。GOD在水相中固定化后，固定化酶的Km值因固定化材料的不同而存在差異。但是，通過GOD在水相和有機(jī)相的固定化酶的Km比較 (表4) 發(fā)現(xiàn)，GOD在有機(jī)相中以戊二醛活化的殼聚糖微球?yàn)檩d體進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)固定化，固定化酶的Km值均小于GOD在水相中以其他材料為載體時(shí)共價(jià)交聯(lián)固定化的結(jié)果，說明有機(jī)相固定化GOD較水相固定化GOD有良好的底物親和力，固定化GOD的活性中心對(duì)底物的親和力增大；由于酶被固定在載體上，剛性增加，在一定的空間內(nèi)呈現(xiàn)閉鎖狀態(tài)，這種疏水環(huán)境中的動(dòng)力學(xué)“剛性”一定程度上限制了酶活性中心構(gòu)象的變化，GOD的催化產(chǎn)物H2O2因擴(kuò)散阻礙及固定化酶在有機(jī)相共價(jià)交聯(lián)過程中構(gòu)象的相對(duì)穩(wěn)定，使GOD的活力不僅不會(huì)喪失反而會(huì)表現(xiàn)出更好的催化活性，酶的動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為固定化酶的Km減小。這也顯示在有機(jī)相中GOD的共價(jià)交聯(lián)固定化較水相有著很大優(yōu)勢。如表4所示，由于本工作是采用常規(guī)的材料作為載體共價(jià)交聯(lián)固定化化 GOD，所以與納米材料作為載體共價(jià)交聯(lián)的GOD相比優(yōu)勢不明顯[28-31]。納米材料具有卓越的比表面積，能夠非常顯著地提高酶的分散度、傳質(zhì)性質(zhì)和固定的酶量，酶在某些納米材料上固定化表觀出更優(yōu)的Km值是多種因素影響的結(jié)果，有機(jī)相中進(jìn)行的酶的共價(jià)固定化僅可以改善酶在進(jìn)行共價(jià)化學(xué)反應(yīng)時(shí)不會(huì)或較少程度上的因構(gòu)象變化而引起的失活現(xiàn)象。

表4 不同的共價(jià)固定化葡萄糖氧化酶參數(shù)比較Table 4 Parameters of GOD based on different covalent immobilization

3 討論

本研究利用酶在有機(jī)相中構(gòu)象穩(wěn)定的特點(diǎn)，嘗試了在 1,4-二氧六環(huán)、乙醇、乙醚相對(duì) GOD進(jìn)行共價(jià)固定化。與傳統(tǒng)水相共價(jià)固定化相比，有機(jī)相固定化使GOD在酶比活力、酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)方面均表現(xiàn)一定的優(yōu)勢。尤其是 1,4-二氧六環(huán)相固定化 GOD，其固定化酶比活力和有效酶活回收率提高3倍；在連續(xù)使用后，1,4-二氧六環(huán)有機(jī)相固定化GOD的酶活力仍為相應(yīng)水相固定化酶的 3倍。在酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)方面，對(duì)于表觀米氏常數(shù)，最大反應(yīng)速度還是轉(zhuǎn)換數(shù)，1,4-二氧六環(huán)有機(jī)相固定化的 GOD都優(yōu)于水相共價(jià)固定化GOD。

由于酶的活性主要是靠酶蛋白的構(gòu)象維持的，可以推斷，在固定化過程中，有機(jī)相與水相相比，GOD在前者的環(huán)境中，有更多的酶分子保持了正確的蛋白構(gòu)象，這也間接地說明 GOD在進(jìn)行共價(jià)固定化操作過程中，經(jīng)過優(yōu)選有機(jī)相比水相能夠更好地維系酶蛋白的天然活性構(gòu)象，有利于提高固定酶的活性。因此，該研究可能為改善酶在共價(jià)固定化過程中的變性問題提供新思路。

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