張充，周孝偉，呂鳳霞，別小妹，陶婷婷，應(yīng)琦，陸兆新

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 酶工程研究室，江蘇 南京 210095

脂肪氧合酶 (Lipoxygenase，LOX) 是一種含非血紅素鐵的蛋白，催化具有順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸的雙加氧反應(yīng)，如亞油酸、亞麻酸。脂肪氧合酶廣泛存在于植物、動(dòng)物[1-2]中，在微生物中鮮有發(fā)現(xiàn)。LOX在食品加工中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在面粉加工過程中可催化分子氧對(duì)面粉中的具有戊二烯1,4雙鍵的油脂發(fā)生氧化，形成的不穩(wěn)定的氫過氧化物能誘導(dǎo)面筋蛋白質(zhì)分子聚合，從而起到增強(qiáng)面筋的作用，可以減少或替代強(qiáng)筋劑溴酸鉀的使用[3]。歐美等國(guó)家在90年代就有添加大豆粉改善面粉品質(zhì)的專利出現(xiàn)[4]；同時(shí)，近年來，生物合成法外源催化合成風(fēng)味物質(zhì)成為一條經(jīng)濟(jì)可行的路線，逐漸被重視，而LOX可以催化生產(chǎn)天然清香味化合物，可以滿足人們對(duì)綠色風(fēng)味物質(zhì)的追求。

盡管人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)到LOX在食品加工中的潛在應(yīng)用價(jià)值，且LOX在自然界中廣泛存在，但從自然界中直接獲得不僅得率低而且純化難，獲得LOX純酶的成本很高；而使用富含LOX酶的植物材料，如大豆粉，則存在成分復(fù)雜、反應(yīng)不易控制的缺陷，上述原因限制了脂肪氧合酶在食品、化工等領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。

通過LOX基因的克隆與表達(dá)，經(jīng)簡(jiǎn)單的純化過程，獲得高純度的LOX酶是解決上述問題的極好策略。Casey等[5]提出，重組脂肪氧合酶將成為食品加工領(lǐng)域研究中的前沿。然而，至今為止，還未曾有高效表達(dá)脂肪氧合酶的報(bào)道[6]。究其原因，一是脂肪氧合酶基因多數(shù)來源于真核生物，在原核生物中極少發(fā)現(xiàn)，這些基因在原核中 (如大腸桿菌) 表達(dá)存在稀有密碼子問題，在真核中 (如酵母) 表達(dá)存在糖基化問題；二是LOX基因過長(zhǎng) (2 500~3 000 bp)，也是制約高效表達(dá)的一個(gè)重要因素。為此，本研究在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到原核生物魚腥藻PCC 7120基因組中LOX基因以雙功能酶形式存在，利用逐步縮短策略克隆得到其最短的功能基因，進(jìn)行了定點(diǎn)突變研究，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，并對(duì)重組酶進(jìn)行了分離純化和性質(zhì)研究，為該酶在食品加工中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Anabaena sp. PCC 7120菌株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，Escherichia coli DH5α (△Lac U169 (Φ80 Lac Z △M15) 克隆宿主、E. coli BL21 (DE3) pLysS (F-ompT hsdSB(rB -mB-) gal dcm (DE3) pLysS Camr) 為本實(shí)驗(yàn)室保藏。Escherichia coli表達(dá)載體 pET-23a、pET-32a購(gòu)自Novagen公司，pGS21a購(gòu)自南京金斯特公司。

限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、SacⅠ、氨芐青霉素、DNA凝膠回收試劑盒、基因組提取試劑盒、DNA marker、瓊脂糖、IPTG購(gòu)自上海生工生物工程公司。pfu DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物公司；亞油酸購(gòu)自Sigma公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。加水溶解后，用5 mol/L NaOH將pH調(diào)到7.0。加水定容到1 000 mL。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，按每100 mL加入瓊脂粉1.5 g。

重組大腸桿菌的表達(dá)培養(yǎng)基：配制20%葡萄糖，0.075 MPa滅菌20 min，添加至上述LB中，終濃度為0.2%。

1.2 方法

1.2.1 Anabaena sp. PCC 7120脂肪氧合酶基因的搜索

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中輸入“l(fā)ipoxygenase”對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的所有基因組信息進(jìn)行檢索；使用Clustalx軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析；使用 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast和http://pfam.sanger.ac.uk網(wǎng)站進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

1.2.2 ana-LOX基因的定點(diǎn)突變

運(yùn)用重疊延伸PCR (over-lap extension PCR，SOE-PCR) 技術(shù)[7]，設(shè)計(jì)2個(gè)PCR反應(yīng)以產(chǎn)生2個(gè)含突變位點(diǎn)的DNA片段，分別用引物L(fēng)-F、L-R和R-F、R-R擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的上游片段L和下游片段R，隨后將上述兩個(gè)PCR產(chǎn)物混合，二者通過末端互補(bǔ)區(qū)結(jié)合并在適宜的溫度下互為引物延伸得到完整的含突變的基因。突變位點(diǎn)選擇是根據(jù)序列分析預(yù)測(cè)出活性位點(diǎn)，分別為His197、His202、His369、Asn373和 Ile455，并且隨機(jī)選擇了His364、Asn419和Ile326作為活性中心位點(diǎn)的佐證。表1為ana-LOX基因定點(diǎn)突變引物及突變方向。

表1 定點(diǎn)突變用引物Table 1 Synthetic primers for site-direct mutation

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1.2.3 Anabaena sp. PCC 7120脂肪氧合酶功能基因的克隆

參考GenBank中Anabaena sp. PCC 7120基因組序列[8](Accession No. NC_003267)，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)只編碼脂肪氧合酶功能序列的引物。

Ana-LOX含有 5個(gè)保守活性位點(diǎn)，只有 5個(gè)活性位點(diǎn)均存在才具有活性。因此，將當(dāng)N端邊緣氨基酸為保守殘基時(shí)的基因長(zhǎng)度設(shè)定為最短基因長(zhǎng)度，將已經(jīng)證明具有活性的ana-LOX基因長(zhǎng)度設(shè)定為最長(zhǎng)基因長(zhǎng)度。采用分別截取，逐步測(cè)定基因活性，最終精確到一個(gè)三聯(lián)體長(zhǎng)度的差別，方案如圖1所示。表2為鑒定ana-LOX基因功能基因長(zhǎng)度的引物。

1.2.4 大腸桿菌ana-LOX基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建

凝膠回收的 PCR產(chǎn)物以及表達(dá)載體pET-23a、pET-32a和 pGS21a-ana-LOX分別用BamHⅠ酶切處理，再分別凝膠回收純化，用T4 DNA連接酶置于16 ℃連接過夜后，全部轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。涂布于含有氨芐青霉素的LB平板，倒置，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于10 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩10 h，小量提取質(zhì)粒。電泳鑒定重組子。送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。獲得重組表達(dá)載體 pET-23a-ana-LOX、 pET-32a-ana-LOX、pGS21a-ana-LOX。

圖1 逐步縮短基因長(zhǎng)度策略Fig. 1 Strategy for shortening the ana-LOX gene.

表2 Ana-LOX基因縮短用引物Table 2 Synthetic primers for shortening ana-LOX gene

1.2.5 目的基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

分別挑取含有重組表達(dá)載體 pET-23aana-LOX、pET-32a-ana-LOX、pGS21a-ana-LOX的重組菌和對(duì)照菌E. coli BL-21 (DE3) 以及含空載體的對(duì)照菌體，接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的液體 LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)14 h。再分別取8 mL種子液到500 mL 三角瓶中，加入100 mL上述LB培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加IPTG至100 mg/L，37 ℃、180 r/min誘導(dǎo)5 h或者低溫16 ℃誘導(dǎo)15 h，4℃、10 000×g離心5 min，收集菌體。

1.2.6 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE電泳參照 Lorenzi等[1]報(bào)道的方法進(jìn)行，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%，膠厚 1.0 mm。電泳完畢后，取出凝膠，固定、考馬斯亮藍(lán)R-250染色、脫色后觀察并拍照。

1.2.7 重組脂肪氧合酶的分離純化

將誘導(dǎo)表達(dá)收集到的菌體，用磷酸緩沖液(50 mmol/L PBS+0.3 mol/L NaCl+0.5% Triton X-100) 重懸菌體，超聲波破碎菌體 (400 W，超聲5 s，間歇10 s，共超聲15 min)，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清液作為粗酶液。

將處理得到的粗酶液按照 Ni-NTA His Tag Kit說明書依次用含不同濃度咪唑 (50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L) 的洗脫液洗脫Ni-NTA柱，收集洗脫峰，測(cè)定脂肪氧合酶活性。

1.2.8 酶活力測(cè)定

脂肪氧合酶活性分析用亞油酸鈉作為底物。酶反應(yīng)體系中含有：pH 6.0的磷酸緩沖液2.79 mL，酶液10 μL，亞油酸鈉200 μL，混勻后放入35 ℃水浴中并開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)3 min后測(cè)定吸光度[9]。酶活單位定義：在上述條件下以1 min內(nèi)3 mL反應(yīng)體系在234 nm的吸光度增加0.001作為一個(gè)酶活力單位U[10]。

1.2.9 重組脂肪氧合酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

重組脂肪氧合酶的最適反應(yīng)溫度：將緩沖液分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃水浴中保溫10 min，加入10 μL待測(cè)酶液，在不同溫度下反應(yīng)3 min，在234 nm下測(cè)定吸光值，以不加酶的溶液作對(duì)照。以溫度為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)作圖，得到該酶的最適反應(yīng)溫度。

重組脂肪氧合酶的熱穩(wěn)定性：將待測(cè)酶液(溶在0.2 mol/L pH 6.0 PBS緩沖液中) 分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃水浴中保溫1 h，每隔10 min取出一組樣品，迅速置于冰水中，待保溫結(jié)束后統(tǒng)一進(jìn)行酶活力測(cè)定，以未處理酶液作為對(duì)照。以溫度為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)，得到溫度對(duì)酶活力的影響曲線。

重組脂肪氧合酶的最適pH值：以亞油酸鈉為底物，在pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖液中，按酶活力測(cè)定方法中所述，進(jìn)行酶活測(cè)定。

重組脂肪氧合酶的pH穩(wěn)定性：將重組脂肪氧合酶在不同pH值的緩沖液中，30 ℃保溫1 h，測(cè)定剩余的酶活力。

重組金屬離子對(duì)酶活性影響：將各種金屬離子與酶液混合，使其最終濃度達(dá)到10 mmol/L，然后在30 ℃下測(cè)定酶活，均以不加金屬離子的酶液為空白對(duì)照組，以未處理的酶液的酶活為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 Anabaena sp. PCC 7120脂肪氧合酶基因的序列分析

在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/) 中搜索到了Anabaena sp. PCC 7120脂肪氧合酶酶基因與丙二烯氧合酶以雙功能酶(AOS-LOX，NC_003267) 形式存在，LOX活性中心位于雙功能酶C端。將AOS-LOX的C端覆蓋 LOX活性位點(diǎn)的 455氨基酸輸入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)該段序列屬于脂肪氧合酶家族。將該段455氨基酸序列輸入http://pfam.sanger.ac.uk網(wǎng)站，分析該段序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守模塊，發(fā)現(xiàn)該段序列中含有脂肪氧合酶保守功能模塊。將該段序列與其他來源的LOX進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)[11-14]，找到了LOX活性中心定位鐵離子的5個(gè)保守氨基酸殘基位點(diǎn)分別為His197、His202、His369、Asn373和Ile455。

2.2 Ana-LOX基因的克隆及其在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

參考GenBank中Anabaena sp. PCC 7120基因組序列 (Accession No. NC_003267)，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)了擴(kuò)增雙功能酶C端455氨基酸殘基基因序列 (1 368 bp) 的引物：上游引物：5′-CGCGA GCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3′；下游引物：5′-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATA CTCATCAT-3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見1 368 bp處的片段。以構(gòu)建的重組質(zhì)粒 pET-23a- ana-LOX、pET-32a-ana-LOX、pGS21a-ana-LOX進(jìn)行 BamHⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果得到長(zhǎng)約1 368 bp的片段，酶切結(jié)果與預(yù)期目標(biāo)一致。測(cè)序結(jié)果與 GenBank公布的序列一致，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將3個(gè)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3) pLysS表達(dá)宿主菌，篩選獲得的重組子通過IPTG的誘導(dǎo)作用，均獲得了ana-LOX的活性表達(dá)，酶活測(cè)定結(jié)果如圖 2所示。其中 pET-32aana-LOX的活性表達(dá)最高，并且16 ℃低溫條件下誘導(dǎo)表達(dá)獲得的酶活性均高于30 ℃條件下的表達(dá)結(jié)果。

因此，選取了帶有分子伴侶 Trx的pET-32a-ana-LOX的重組表達(dá)載體進(jìn)行下一步研究。當(dāng)IPTG濃度為1 g/L，誘導(dǎo)時(shí)間16 h，誘導(dǎo)時(shí)機(jī) OD600為 0.8，誘導(dǎo)溫度為 16 ℃的培養(yǎng)條件下，重組脂肪氧合酶活力可達(dá)(6 750±40) U/mL。

圖2 Ana-LOX E. coli工程菌在16 ℃和30 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)酶活測(cè)定Fig. 2 Production of active recombinant ana-LOX in recombinant E. coli at 16 °C and 30 °C condition.

2.3 Ana-LOX基因的定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變酶基因的克隆采用SOE-PCR的方法，各個(gè)突變基因與表達(dá)載體連接酶切驗(yàn)證并測(cè)序正確后，采用熱激法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入E. coli BL21 (DE3) pLysS，酶活測(cè)定結(jié)果見表3。 His197、His202、His369、Asn373、Ile455位點(diǎn)的所有突變基因均無活性，而隨機(jī)選擇His364、Asn419、Asn326位點(diǎn)的所有突變基因均維持原有活性，證明His197、His202、His369、Asn373、Ile4555個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)為ana-LOX活性中心的保守位點(diǎn)。

表3 定點(diǎn)突變基因活性測(cè)定Table 3 Activity of site-directed mutation

2.4 Ana-LOX功能基因的長(zhǎng)度

不同長(zhǎng)度的 ana-LOX基因與表達(dá)載體pET-32a連接，獲得工程菌誘導(dǎo)發(fā)酵后，酶活結(jié)果見表4。1 368~1 254 bp長(zhǎng)度的ana-LOX基因酶活基本一致，1 254~1 233 bp長(zhǎng)度的ana-LOX基因酶活逐步開始降低，當(dāng)ana-LOX基因長(zhǎng)度縮短為 1 230 bp時(shí)，酶活完全喪失。因此，ana-LOX的最適基因片段長(zhǎng)度為1 254 bp，重組脂肪氧合酶的分離純化及性質(zhì)研究選擇均選擇1 254 bp進(jìn)行研究。

2.5 重組ana-LOX蛋白表達(dá)形式鑒定

分別取適量 pET-32a-ana-LOX工程菌及含空載體的對(duì)照菌體，誘導(dǎo)發(fā)酵超聲波破碎菌并離心后，上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果如圖3所示，重組蛋白全部以可溶性形式存在于細(xì)胞裂解物的上清中。

2.6 重組ana-LOX分離純化

按照Ni-NTA His Tag Kit說明書，依次用含不同濃度咪唑 (50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L) 的洗脫液洗脫Ni-NTA柱，收集洗脫峰，測(cè)定脂肪氧合酶活性。結(jié)果如表 5所示，當(dāng)咪唑?yàn)?150 mmol/L時(shí)，通過 Ni-NTA層析一步純化，比活達(dá)到11.4×104U/mg蛋白，純化倍數(shù)達(dá)到23倍，酶活回收率為 60.89%。如圖 4所示，對(duì)純化重組酶進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示純化效果較好。

表4 不同基因長(zhǎng)度的ana-LOX活性測(cè)定Table 4 Activity of ana-LOX with different gene length

表5 Ni-NTA層析柱純化重組蛋白Table 5 Purification of recombinant His6-ana-LOX

純化后的融合蛋白在 SDS-PAGE中顯示為一條帶 (圖 5)。泳道 1為重組的融合蛋白Trx-ana-LOX，用Bio-Rad Quantity One 4.6.2凝膠分析軟件計(jì)算其分子量約為70 kDa左右，與理論值基本一致。

2.7 重組ana-LOX的性質(zhì)研究

2.7.1 重組酶反應(yīng)的最適pH

將純化的重組酶在不同的pH條件下與底物反應(yīng)后，測(cè)定各條件下的活力。不同pH值對(duì)重組脂肪氧合酶活力的影響。如圖5所示，重組脂肪氧合酶反應(yīng)的最適pH值為6.0。

2.7.2 重組酶反應(yīng)的最適溫度

將純化的重組酶在不同的溫度條件下與底物反應(yīng)后，測(cè)定各條件下的活力。結(jié)果表明重組酶的最佳反應(yīng)溫度為45 ℃ (圖6)。

2.7.3 重組酶的熱穩(wěn)定性

對(duì)重組ana-LOX的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。如圖7所示，在20 ℃條件下保溫1 h，酶活降低到對(duì)照組的83%，30 ℃條件保溫25 min，酶活降低為對(duì)照組的50%，40 ℃和50 ℃條件下酶的較易失活，保溫10 min后酶活分別降低為對(duì)照組的50%和40%。

圖3 SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達(dá)形式Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the solubility of expressed protein. 1: the crude extracts from cells carrying pET-32a (control); 2: the supernatant of the disrupted cells carrying pET-32a-ana-LOX, recombinant Trx-ana-LOX is indicated by arrowhead; 3: inclusion bodies of cells carrying pET-32a-ana-LOX; M: protein marker.

圖4 純化后重組ana-LOX SDS-PAGE電泳Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant ana-LOX.

2.7.4 金屬離子對(duì)重組酶活性的影響

金屬離子對(duì)酶活的影響見表 6。其中 Fe2+對(duì)重組ana-LOX具有強(qiáng)烈的激活作用，與對(duì)照組相比，能提高到 181.91%，F(xiàn)e3+和 Cu2+對(duì)重組 ana-LOX有強(qiáng)烈的抑制作用，能完全抑制ana-LOX活性。Mg2+和Ca2+對(duì)重組ana-LOX具有一定激活作用；Na+、Zn2+和 Mn2+對(duì)重組ana-LOX具有一定的抑制作用。

圖5 pH對(duì)重組酶的活力的影響Fig. 5 Effect of pH on recombinant ana-LOX activity.

圖6 溫度對(duì)重組酶活力的影響Fig. 6 Effect of temperature on recombinant ana-LOX activity.

圖7 Ana-LOX熱穩(wěn)定性Fig. 7 Thermal stability of recombinant ana-LOX.

表6 金屬離子對(duì)重組ana-LOX活性的影響Table 6 Effect of metal ions (10 mmol/L) on recombinant ana-LOX

2.8 重組Ana-LOX對(duì)面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖8分別為對(duì)照面團(tuán) (A)、每克面粉添加80 U (80 U/g) 重組 Ana-LOX處理的面團(tuán) (B)和每克面粉添加添加50 μg KBrO3(50 μg/g) (C)處理的面團(tuán)在500倍放大倍數(shù)下的SEM顯微結(jié)構(gòu)圖片。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較 (A)，經(jīng)重組Ana-LOX處理后的面團(tuán)結(jié)構(gòu)的變化明顯，可以清晰地看到少量絲狀結(jié)構(gòu)變成完整的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而淀粉顆粒則存在于交錯(cuò)的面筋網(wǎng)絡(luò)之間 (B)，與KBrO3處理所得結(jié)果基本相似 (C)。重組Ana-LOX在改善面團(tuán)結(jié)構(gòu)方面表現(xiàn)出了良好的效果，有待進(jìn)一步研究。

圖8 面團(tuán)的SEM顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.8 SEM results of the dough with no enzyme treatment. (A) Control. (B) With 80 U/g dough ana-LOX treated. (C) With 50 μg/g dough KBrO3 treated.

3 討論

關(guān)于脂肪氧合酶的異源表達(dá)早有學(xué)者開始研究。分別對(duì)氰細(xì)菌、水稻、大豆等多種[6,12-15]來源的LOX基因在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)研究，但活性表達(dá)量都很低。LOX基因至今表達(dá)量不高主要由于多數(shù)來源于真核生物，異源表達(dá)過程中存在基因長(zhǎng)度過長(zhǎng)、稀有密碼子以及翻譯后加工修飾等問題。因此，尋找新型原核來源的LOX基因，對(duì)于開發(fā)LOX成為新型食品添加劑具有重要的意義。

本研究通過在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，發(fā)現(xiàn)Anabaena sp. PCC 7120基因組中含有LOX基因，以雙功能酶形式存在。通過氨基酸序列比對(duì)和活性位點(diǎn)的推測(cè)發(fā)現(xiàn)LOX活性中心為雙功能酶的C端，并從C端擴(kuò)增了一段只包含脂肪氧合酶活性中心的基因 (ana-LOX)。雖然與其他來源的LOX同源性很低 (表7)，但是，保守區(qū)、二級(jí)結(jié)構(gòu)域以及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)均發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到的ana-LOX基因?qū)儆贚OX家族。由于ana-LOX基因具有原核來源、基因長(zhǎng)度 (1 368 bp) 比其他來源的基因小許多，因此，具有實(shí)現(xiàn)LOX高效異源表達(dá)的潛力。

本研究結(jié)果表明，擴(kuò)增的ana-LOX在E. coli中獲得了活性表達(dá)，酶活達(dá)到 6 750 U/mL。Ana-LOX基因在不同的表達(dá)載體表現(xiàn)出不同的酶活產(chǎn)量，表明分子伴侶能夠影響重組ana-LOX的活性表達(dá)量，分子伴侶Trx優(yōu)于GST。低溫發(fā)酵能夠避免包涵體的形成[16]，在16 ℃條件下，重組ana-LOX全部以可溶性形式出現(xiàn)，該結(jié)果屬首次報(bào)道。通過Ni柱一步純化過程，獲得了電泳純的重組蛋白條帶，對(duì)重組ana-LOX酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究的。金屬離子能夠影響酶活性，F(xiàn)e2+能夠顯著提高重組ana-LOX酶活，而Cu2+和Fe3+能夠完全抑制重組ana-LOX酶活。我們分析金屬離子的氧化性質(zhì)影響到重組ana-LOX Fe原子的價(jià)態(tài)變化從而影響到酶活。

大豆 LOX-1的空間結(jié)構(gòu)已被解析，活性保守位點(diǎn)即Fe3+定位殘基為His499、His504、His690、Asn694和 Ile839[13]。通過序列比對(duì)和空間結(jié)構(gòu)模擬，我們預(yù)測(cè)到ana-LOX的保守位點(diǎn)為His197、His202、His369、Asn373和Ile455。LOX的氧化活性是通過的 Fe3+價(jià)態(tài)的變換實(shí)現(xiàn)的[15]，因此定位Fe3+的氨基酸殘基會(huì)通過電子間的競(jìng)爭(zhēng)影響LOX的活性。為了提高LOX的活性，采用定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行了定向進(jìn)化研究。然而通過將保守位點(diǎn)分別突變?yōu)橹行?、堿性、酸性氨基酸，獲得的突變基因在E. coli均為無活性表達(dá)。Mirela等在研究Mn脂肪氧合酶過程中，定點(diǎn)突變后發(fā)現(xiàn)突變基因表達(dá)出的重組酶喪失了活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)突變重組酶檢測(cè)不到 Mn離子[17]。因此，推測(cè)ana-LOX保守位點(diǎn)的突變也同樣導(dǎo)致了Fe3+無法定位。通過大量的定點(diǎn)突變，沒有得到活性提高的突變基因，但是，該結(jié)果證明了ana-LOX保守氨基酸位點(diǎn)確實(shí)與預(yù)測(cè)的一致。為了對(duì)該結(jié)論加以佐證，我們隨機(jī)選擇了其他位點(diǎn)的相同氨基酸進(jìn)行突變，突變基因表達(dá)出的重組ana-LOX均具有活性。今后的工作可以在此基礎(chǔ)上，對(duì)活性中心位點(diǎn)周邊的殘基進(jìn)行突變，以期獲得性能改良的突變酶。

表7 ana-LOX與其他來源LOX序列同源性Table 7 Identity of ana-LOX to other resource of LOX

通過信息學(xué)分析，以及定點(diǎn)突變研究，位于ana-LOX C末端的Ile是活性中心不可缺少的氨基酸殘基。同理，我們考慮ana-LOX N端也應(yīng)該存在一個(gè)過渡區(qū)域，決定了ana-LOX基因的最短長(zhǎng)度。通過從ana-LOX基因5￠端逐步縮短基因長(zhǎng)度，首次發(fā)現(xiàn)ana-LOX基因長(zhǎng)度存在一個(gè)過渡區(qū)域，即當(dāng)基因長(zhǎng)度長(zhǎng)于1 254 bp時(shí)，表達(dá)的重組LOX活性處于同一水平，當(dāng)基因長(zhǎng)度縮短為1 254 bp時(shí)，重組酶活逐步降低，至1 230 bp時(shí)，酶活消失。我們分析 C端的氨基酸在維持重組ana-LOX空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性發(fā)揮一定作用。當(dāng)維持空間結(jié)構(gòu)起主要作用的殘基消失，活性結(jié)構(gòu)處于不穩(wěn)定狀態(tài)，或者無法形成活性結(jié)構(gòu)。

對(duì)不同來源的脂肪氧合酶的性質(zhì)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也有不少報(bào)道。Danield等[18]以酪梨為材料分離純化LOX，發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)pH為6.5，最適反應(yīng)溫度為 40 ℃；Jin等[19]的研究結(jié)果表明，豌豆種子的最適反應(yīng)pH為9.0，最適反應(yīng)溫度為39 ℃；陳書婷等[20]對(duì)大豆LOX進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)pH為9.0，在低溫下 (低于40 ℃)保持較高酶活性。本研究中表達(dá)的重組ana-LOX最適反應(yīng)pH為6.0，表明為一種偏酸性酶；最適反應(yīng)溫度為45 ℃，高于其他來源的LOX，有利于在實(shí)際生產(chǎn)加工過程中的應(yīng)用。

本研究實(shí)現(xiàn)了ana-LOX的高效表達(dá)，顯示出ana-LOX基因在食品酶制劑中的巨大應(yīng)用潛力。但是作為宿主的E. coli屬于致病菌，屬于胞內(nèi)表達(dá)，獲得重組蛋白必須經(jīng)過破壁，且需要嚴(yán)格的純化過程以除去致病物質(zhì)才能應(yīng)用于人體。而對(duì)于附加值較低的食品添加劑用酶，高額的純化成本必然會(huì)限制其應(yīng)用。因此，需要尋找安全的表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)胞外分泌表達(dá)。有關(guān)ana-LOX食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建是我們進(jìn)一步研究的重點(diǎn)方向。

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