孫麗慧，于飛飛，鄭裕國(guó)

浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江 杭州 310032

3-羥基丙酸 (3-Hydroxypropionic acid，3-HP)是一種重要的有機(jī)合成中間體，由于其分子兩端分別帶有一個(gè)羥基和一個(gè)羧基，是較為活潑的分子，在合成新型生物可降解性聚合物、個(gè)人護(hù)理用品、膠黏劑和涂料等方面有著廣泛的應(yīng)用前景[1]。目前，3-HP的生產(chǎn)方法主要是化學(xué)合成法，但該方法存在技術(shù)難度較大、生產(chǎn)成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)[1-2]。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，近年來(lái)很多學(xué)者研究了利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-HP，但目前所報(bào)道的采用發(fā)酵法生產(chǎn)3-HP的野生菌株，產(chǎn)量均較低，只能通過(guò)基因工程手段構(gòu)建高效代謝途徑，但需要較多基因的克隆，工程菌的構(gòu)建具有一定的難度[3-5]。陳國(guó)強(qiáng)等將1,3-丙二醇脫氫酶和醛基氧化酶在宿主細(xì)胞中共表達(dá)，以1,3-丙二醇為原料發(fā)酵生產(chǎn)3-HP，最終發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度最高為 12.1 g/L[6]；Rathnasingh等將甘油脫水酶與醛脫氫酶偶聯(lián)表達(dá)，以甘油為底物，最終在發(fā)酵液中3-HP產(chǎn)量能夠達(dá)到38.7 g/L，這也是目前文獻(xiàn)報(bào)道中利用發(fā)酵法能夠取得最好的結(jié)果[7]。

本研究室前期成功篩選并經(jīng)誘變得到了一株氧化葡萄糖酸桿菌 ZJB09112 (Gluconobacter oxydans ZJB09112)[8-10]，該菌最顯著的特點(diǎn)就是在其細(xì)胞膜上存在著多種脫氫酶，能夠?qū)⒈姸嗵谴碱?lèi)化合物不完全氧化，生成相應(yīng)的產(chǎn)物醛、酮以及酸，這一過(guò)程的電子傳遞鏈由泛醌、細(xì)胞色素O和細(xì)胞色素O還原性酶組成，氧作為電子受體，并且該電子傳遞鏈與ADP氧化磷酸化形成ATP的過(guò)程相耦合[11-14]。由于膜系脫氫酶的氧化產(chǎn)物可以直接分泌到細(xì)胞外，催化過(guò)程無(wú)需跨膜運(yùn)輸，且氧化效率很高，因而近年來(lái)對(duì)G. oxydans在生物催化應(yīng)用方面的研究，受到了極大關(guān)注。在前期實(shí)驗(yàn)中，本課題組已經(jīng)利用該菌對(duì)以甘油為底物合成1,3-二羥基丙酮做了大量的研究工作，并將所取得成果成功地實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，現(xiàn)已在浙江海正藥業(yè)股份有限公司構(gòu)建了年產(chǎn)1 000 t的1,3-二羥基丙酮生產(chǎn)線，生產(chǎn)技術(shù)指標(biāo)達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平[12]。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有利用G. oxydans生物催化合成維生素C、米格列醇、葡萄糖酸、D-乳酸、1,3-二羥基丙酮、羥基乙酸等相關(guān)研究[11,15-21]。本文以G. oxydans ZJB09112靜息細(xì)胞作為生物催化劑，利用其不完全氧化特性，催化1,3-丙二醇合成3-HP，反應(yīng)過(guò)程如圖1所示，考察了細(xì)胞加入量、底物抑制和產(chǎn)物抑制對(duì)催化反應(yīng)的影響，并采取適當(dāng)?shù)难a(bǔ)料方式和生物轉(zhuǎn)化與分離相耦合的手段解除抑制，以提高目標(biāo)產(chǎn)物終濃度。同時(shí)，本研究也能為加深了解G. oxydans不完全氧化醇類(lèi)化合物的特性奠定一定的理論基礎(chǔ)，有助于發(fā)現(xiàn)和開(kāi)拓它在工業(yè)催化中的新用途。

圖1 氧化葡萄糖酸桿菌生物催化1,3-丙二醇合成3-羥基丙酸Fig. 1 Biocatalysis of 1,3-propanediol to 3-hydroxypropionic acid by Gluconobacter oxydans.

1 材料與方法

1.1 菌種和試劑

氧化葡萄糖酸桿菌 ZJB09112 (G. oxydans ZJB09112)，為本實(shí)驗(yàn)篩選保藏，于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，公共保藏編號(hào)為 CCTCC No: M208069。1,3-丙二醇購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；3-HP購(gòu)自日本東京化成株式會(huì)社；樹(shù)脂購(gòu)于上海華振有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉30，甘油5。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：甘油24，甘露醇6，酵母粉 7，蛋白胨 1，MgCl21，(NH4)2SO41，KH2PO41。

1.3 菌體培養(yǎng)方法

從菌種斜面接種兩環(huán)至裝有 50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，于30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子。將種子液以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min發(fā)酵培養(yǎng)22 h，離心收集菌體并用生理鹽水洗滌2次用于生物轉(zhuǎn)化。

1.4 樹(shù)脂的選擇和預(yù)處理

由于 3-HP為弱酸性有機(jī)酸 (pKa=4.5)，根據(jù)離子交換理論，應(yīng)選用堿性樹(shù)脂作為原位分離介質(zhì)。以往研究表明，弱堿性陰離子交換樹(shù)脂對(duì)羥基酸的吸附容量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂。所以，本實(shí)驗(yàn)代表性地選取了工業(yè)上應(yīng)用廣泛的幾種弱堿性陰離子交換樹(shù)脂，D301 (苯乙烯系)、D314 (丙烯酸系)、D315 (丙烯酸系) 和D335 (環(huán)氧系)，比較了其對(duì)3-HP的吸附性能，并對(duì)洗脫劑進(jìn)行了選擇。

樹(shù)脂預(yù)處理：首先將樹(shù)脂用乙醇浸泡4 h，使其充分溶脹并除去有機(jī)雜質(zhì)；然后用1 mol/L NaOH浸泡24 h，水洗至中性；再用1 mol/L HCl浸泡24 h，水洗至中性；最后用1 mol/L NaOH浸泡24 h，實(shí)現(xiàn)樹(shù)脂轉(zhuǎn)型，水洗至中性，抽濾后保藏備用。

1.5 生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)

50 mL搖瓶中轉(zhuǎn)化：取適量濕菌體，懸浮于緩沖溶液中，加入適量1,3-丙二醇，總反應(yīng)體系為10 mL。在30 ℃、180 r/min下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，反應(yīng)初速度通過(guò)轉(zhuǎn)化前10 min的產(chǎn)物量計(jì)算，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 L鼓泡塔中轉(zhuǎn)化：初始反應(yīng)體系為1 L，在控制合適的通氣量和pH條件下，定時(shí)取樣分析底物濃度，通過(guò)流加補(bǔ)料的方式和產(chǎn)物原位分離手段解除抑制。

1.6 分析方法

1,3-丙二醇濃度用氣相色譜 (GC-14B，日本島津公司) 檢測(cè)，色譜柱為HP-5，升溫程序?yàn)椋?0 ℃保持2 min，然后以5 ℃/min升溫至110 ℃，保持1 min，汽化室與檢測(cè)器溫度均為260 ℃，載氣為N2，流速1 mL/min，進(jìn)樣量1 mL，采用外標(biāo)法定量；3-HP采用高效液相色譜(1100 series，美國(guó)安捷倫公司) 檢測(cè)，色譜柱為Hypersil ODS2，色譜分析條件：流動(dòng)相為20 mmol/L KH2PO4緩沖液 (用磷酸調(diào)pH為2.4)，流速0.8 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL，采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物催化1,3-丙二醇合成3-HP

2.1.1 靜息細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

在一定程度上，靜息細(xì)胞的添加量代表著反應(yīng)體系中的酶濃度，因此提高反應(yīng)體系中細(xì)胞濃度，有助于加快酶催化反應(yīng)速度。在30 ℃、100 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液pH 5.5條件下，添加1,3-丙二醇濃度20 g/L，考察細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。從圖2結(jié)果可知，隨著細(xì)胞濃度的增加，酶催化反應(yīng)初速度逐漸增加，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到6 g/L以后，產(chǎn)物得率和反應(yīng)初速度均達(dá)到了較高水平，繼續(xù)增加細(xì)胞濃度，成本會(huì)大大增加，然而對(duì)酶催化的轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)初速度卻不再有明顯增加，一方面，這可能是由于該氧化反應(yīng)需要較多的氧氣參與，而轉(zhuǎn)化瓶中的溶氧有限，從而限制了酶的催化活性，另一方面，反應(yīng)體系中添加過(guò)多的細(xì)胞會(huì)隨著搖床轉(zhuǎn)動(dòng)，細(xì)胞粘附在瓶壁上而未能發(fā)揮催化作用。因而綜合考慮，選擇該轉(zhuǎn)化反應(yīng)最適細(xì)胞濃度為6 g/L。

2.1.2 底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

在 30 ℃、100 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 5.5) 條件下，細(xì)胞濃度6 g/L，考察不同初始底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。從圖3結(jié)果可知，在底物濃度低于15 g/L時(shí)，隨著底物1,3-丙二醇濃度的增加，酶催化反應(yīng)初速度及3-HP的終產(chǎn)量均在逐漸增加，而當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)20 g/L時(shí)，隨著底物濃度的增加，底物抑制作用開(kāi)始顯現(xiàn)，酶催化反應(yīng)初速度及轉(zhuǎn)化率明顯下降且3-HP產(chǎn)量也不再增加。因此，需控制底物量不超過(guò)20 g/L。

2.1.3 產(chǎn)物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

在30 ℃、100 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液pH 5.5條件下，細(xì)胞濃度6 g/L，底物濃度20 g/L，考察在轉(zhuǎn)化初始添加不同濃度產(chǎn)物對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。從圖4結(jié)果可知，產(chǎn)物3-HP對(duì)細(xì)胞催化活力具有一定的抑制作用，并隨著產(chǎn)物添加濃度的增大，抑制作用越來(lái)越明顯。當(dāng)初始產(chǎn)物添加量為40 g/L時(shí)，酶催化效率僅為對(duì)照組的40%，而當(dāng)產(chǎn)物量達(dá)到60 g/L時(shí)，催化效率僅為對(duì)照組的1%，反應(yīng)幾乎接近終止。因此，反應(yīng)過(guò)程中及時(shí)移除產(chǎn)物，減少產(chǎn)物抑制是提高產(chǎn)率的一種重要手段。

圖2 細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig. 2 Effect of cell concentration on biotransformation reaction.

圖3 初始底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig. 3 Effect of initial substrate concentration on biotransformation reaction.

圖4 產(chǎn)物添加量對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig. 4 Effect of different addition concentration of product on biotransformation reaction.

2.1.4 pH對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響

反應(yīng)體系中pH值不僅影響底物分子的離子化狀態(tài)，也能夠影響酶蛋白分子的離子化狀態(tài)，從而影響酶催化反應(yīng)的效率。在 30 ℃的條件下，選取檸檬酸鹽緩沖液 (pH 3.0~6.0)、磷酸鹽緩沖液 (pH 5.0~6.0) 和 Tris-HCl緩沖液(pH 6.0~8.0)，緩沖液濃度均為100 mmol/L，在10 mL反應(yīng)體系中，底物1,3-丙二醇加入濃度為20 g/L，細(xì)胞加入濃度6 g/L，反應(yīng)20 min，考察不同緩沖溶液中pH值對(duì)酶催化活性的影響。從圖5結(jié)果可知，當(dāng)pH值在5.5時(shí)，酶表現(xiàn)出最大的活力，且在以檸檬酸鹽緩沖液中酶活力相對(duì)最高，但考慮檸檬酸影響后期樹(shù)脂吸附能力，因此選擇轉(zhuǎn)化體系為pH 5.5的磷酸鹽緩沖液。

圖6為在30 ℃、細(xì)胞濃度6 g/L，底物濃度20 g/L，通氣量60 L/h，初始pH 5.5，1 L鼓泡塔體系中，考察pH控制與否對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響。從結(jié)果可知，對(duì)于該轉(zhuǎn)化反應(yīng)，若不控制 pH，伴隨著產(chǎn)物 3-HP的積累，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系 pH的逐漸下降，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到6 h，pH就已迅速降到 4.0，而酶作為生物催化劑，都存在一個(gè)最適合的pH范圍，當(dāng)pH降到3.8時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物基本不再積累，此時(shí)pH控制在5.5恒定組轉(zhuǎn)化率已高達(dá)90.1%，而對(duì)照組僅為65.5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pH維持在5.5時(shí)有利于3-HP的合成。

2.1.5 用流加補(bǔ)料方式轉(zhuǎn)化1,3-丙二醇合成3-HP

圖5 緩沖液pH值對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig. 5 Effect of buffer pH on biotransformation reaction.

圖6 pH對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響Fig. 6 Effect of pH on biotransformation process.

搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)20 g/L就會(huì)對(duì)細(xì)胞催化活性產(chǎn)生抑制作用，為了消除底物抑制作用，在30 ℃、細(xì)胞濃度6 g/L，初始底物濃度20 g/L，通氣量60 L/h，pH 5.5條件下，1 L鼓泡塔體系中，定期取樣，采取手動(dòng)間歇補(bǔ)加底物1,3-丙二醇的方式，控制催化過(guò)程中底物濃度維持在15~20 g/L，結(jié)果如圖7所示。在催化反應(yīng)初期 (0~15 h)，產(chǎn)物迅速積累，當(dāng)產(chǎn)物達(dá)到40 g/L時(shí)，產(chǎn)物抑制效應(yīng)逐漸顯現(xiàn)，產(chǎn)物合成速率下降。由于在鼓泡塔中能夠較好地控制通氣條件和恒定的pH值，因此與搖瓶中轉(zhuǎn)化反應(yīng)相比，產(chǎn)物濃度和催化效率都有明顯的提高，當(dāng)產(chǎn)物濃度積累到60 g/L時(shí)，產(chǎn)物抑制效應(yīng)明顯，轉(zhuǎn)化反應(yīng)基本停止。經(jīng)過(guò)60 h的催化反應(yīng)，3-HP的濃度達(dá)到60.8 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.0 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為84.3%。

2.2 生物轉(zhuǎn)化與分離相耦合合成3-HP

2.2.1 樹(shù)脂的選擇

離子交換樹(shù)脂具有吸附容量大、吸附選擇性強(qiáng)、速度快、易解析、易再生等優(yōu)點(diǎn)，因而在轉(zhuǎn)化體系中引入吸附樹(shù)脂可以吸附產(chǎn)物以減輕轉(zhuǎn)化液中的產(chǎn)物抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)選取了幾種對(duì)有機(jī)酸有較好交換容量的弱堿性陰離子交換樹(shù)脂，配制成一定濃度的3-HP溶液，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.5左右，分別加入相同質(zhì)量的樹(shù)脂于30 ℃、180 r/min條件下吸附120 min，從圖8可以看出，樹(shù)脂D335對(duì)3-HP吸附能力最強(qiáng)。

2.2.2 洗脫劑的選擇

D335是一種弱堿性環(huán)氧系陰離子交換樹(shù)脂，選擇適合的洗脫劑，有利于提高目標(biāo)產(chǎn)品的收率。向1.0 g吸附飽和3-HP的D335樹(shù)脂中分別加入5 mL 1.0 mol/L的NaCl、HCl、H2SO4、NH4OH和NaOH溶液，靜態(tài)洗脫24 h，考察了幾種洗脫劑對(duì)3-HP的洗脫效果，如圖9所示?？梢钥闯觯谠摋l件下 Cl-和 SO42-離子在樹(shù)脂D335上的吸附力要強(qiáng)于OH-離子，選用NaCl、 HCl和 H2SO4作為洗脫劑，解析率都可達(dá)到80%以上，其中用HCl解析的效果最好，最終回收率可達(dá) 90%，因此選用 1.0 mol/L HCl作為3-HP的洗脫劑。

圖8 不同樹(shù)脂對(duì)3-羥基丙酸的吸附能力Fig. 8 The adsorption capacity of 3-hydroxypropionic acid by different resins.

圖9 不同洗脫劑對(duì)吸附3-羥基丙酸的D335樹(shù)脂的洗脫情況Fig. 9 Elution of 3-hydroxypropionic acid adsorbed on D335 by different eluants.

2.2.3 生物轉(zhuǎn)化與分離相耦合合成3-HP

從上述結(jié)果可以看出，3-HP對(duì)該酶催化反應(yīng)具有明顯的抑制作用，當(dāng)產(chǎn)物濃度積累到60 g/L時(shí)，產(chǎn)物抑制效應(yīng)明顯，轉(zhuǎn)化反應(yīng)基本停止。為減輕產(chǎn)物抑制，獲得高濃度3-HP并提高生產(chǎn)強(qiáng)度，需要及時(shí)將生成的產(chǎn)物移除。因此，本實(shí)驗(yàn)選用如圖10所示的生物轉(zhuǎn)化與分離相耦合技術(shù)，利用中空纖維膜實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的循環(huán)，同時(shí)利用陰離子交換樹(shù)脂D335對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物不斷進(jìn)行吸附，從而在一定程度上減少產(chǎn)物的抑制作用，提高產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化效率。

由于在反應(yīng)的起始階段產(chǎn)物3-HP的產(chǎn)量較少，所以不啟動(dòng)分離耦合裝置，待反應(yīng)進(jìn)行到12 h以后，開(kāi)始進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化與分離耦合。從圖11結(jié)果可知，采用分批補(bǔ)料生物轉(zhuǎn)化與分離耦合合成3-HP，在不計(jì)算樹(shù)脂上吸附3-HP的量時(shí)，經(jīng)過(guò)50 h的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，3-HP的濃度可達(dá)59.8 g/L。若將 D335樹(shù)脂上吸附的 3-HP充分洗脫，并與轉(zhuǎn)化液中3-HP的量合并計(jì)算，目標(biāo)產(chǎn)物總產(chǎn)量達(dá)76.3 g/L，轉(zhuǎn)化率83.7%，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.5 g/(L·h)。

陳國(guó)強(qiáng)等以1,3-丙二醇為原料，利用工程菌發(fā)酵生產(chǎn) 3-HP，可獲得最高產(chǎn)物濃度為12.1 g/L[6]；Rathnasingh等利用工程菌，以甘油為底物，可獲得最高產(chǎn)物濃度為 38.7 g/L，該結(jié)果也是目前報(bào)道中的最高產(chǎn)量[7]。本文利用G. oxydans生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn) 3-HP，并獲得了最終目標(biāo)產(chǎn)物總產(chǎn)量達(dá) 76.3 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.5 g/(L·h)，本研究中的產(chǎn)物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了利用工程菌發(fā)酵法獲得的最高產(chǎn)量38.7 g/L。由于在生物轉(zhuǎn)化中存在底物和產(chǎn)物抑制效應(yīng)，若能對(duì)本研究中的鼓泡塔中的放大催化工藝以及生物轉(zhuǎn)化與分離相耦合的過(guò)程進(jìn)一步優(yōu)化，目標(biāo)產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度還有提升的空間和潛力。

圖10 生物轉(zhuǎn)化與分離耦合裝置圖Fig. 10 Schematic diagram for bioconversion coupled with in situ product removal. 1: bubble column reactor; 2: hollow fiber membrane; 3: rein packed column.

圖11 分批補(bǔ)料生物轉(zhuǎn)化-分離耦合轉(zhuǎn)化產(chǎn)3-HPFig. 11 Fed-batch biotransformation of 1,3-propanediol to 3-hydroxypropionic acid coupled with in situ product removal.

3 結(jié)論

利用實(shí)驗(yàn)室保藏的G. oxydans ZJB09112生物催化 1,3-丙二醇合成 3-HP，在所考察的因素中，發(fā)現(xiàn)高濃度底物 (≥20 g/L) 和高濃度產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞催化效率和產(chǎn)物合成有明顯的抑制效應(yīng)，并確定了最佳搖瓶催化反應(yīng)條件：6 g/L (DCW)菌體量，pH 5.5。為消除底物抑制作用，在1 L鼓泡塔中，利用流加補(bǔ)料方式維持反應(yīng)體系中底物濃度在15~20 g/L，經(jīng)過(guò)60 h的催化反應(yīng)，3-HP的濃度達(dá)到60.8 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.0 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為 84.3%。為同時(shí)減輕底物和產(chǎn)物抑制效應(yīng)，本研究采用生物轉(zhuǎn)化與D335陰離子交換樹(shù)脂原位分離相耦合的方法，及時(shí)將部分生成的產(chǎn)物移除，經(jīng)過(guò)50 h的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，3-HP的總產(chǎn)量達(dá)76.3 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.5 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為83.7%。

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