王魁，汪思迪，黃睿，劉玉煥

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275

宏基因組學(xué)起源于上世紀(jì)70年代土壤微生物基因組DNA的研究；1980年，Torsvik[1]建立了土壤細(xì)菌總DNA的直接提取方法；1991年，Pace研究組[2]通過(guò)構(gòu)建環(huán)境樣品的DNA文庫(kù)篩選得到16S rRNA基因 (rDNA)，首次證明了從環(huán)境中克隆基因的可行性；1995年，Healy等[3]以木質(zhì)纖維素底物富集培養(yǎng)后的微生物為樣品，通過(guò)構(gòu)建基因組文庫(kù)，篩選得到纖維素酶，證明了從環(huán)境樣品中直接獲得生物催化劑的可行性；1996年，Stein等[4]通過(guò)構(gòu)建海水樣品的基因組文庫(kù)篩選到了一個(gè)新的古菌 16S rRNA基因，確立了環(huán)境基因組學(xué)在挖掘新基因研究中的特殊地位。1998年，Handelsman 等[5]在前人研究的基礎(chǔ)上，首次提出了“宏基因組(Metagenome)”的概念并使用了“Metagenomics”這一名詞，由此宣告了宏基因組學(xué)(Metagenomics) 的誕生。宏基因組是指某一特定生境中全部微生物遺傳物質(zhì)的總和，包含了可培養(yǎng)的和尚不能培養(yǎng)微生物遺傳信息的總和。所謂宏基因組學(xué)就是利用非培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)、方法和手段，對(duì)宏基因組進(jìn)行系統(tǒng)研究，即分析微生物在環(huán)境中的基因組集合，研究其群落結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、相互協(xié)作關(guān)系與生態(tài)功能等。它繞過(guò)了微生物分離培養(yǎng)過(guò)程，成為研究環(huán)境樣品中高達(dá) 99%的不可培養(yǎng)微生物 (Uncultured microorganism) 的有力手段[6]，為后續(xù)的篩選提供更加全面和多樣的基因資源，有效地提高了新型生物催化劑的篩選效率。宏基因組學(xué)從誕生至今僅有十余年時(shí)間，但已引起了世界的廣泛關(guān)注。通過(guò) SCI檢索發(fā)現(xiàn)，自 2002年以來(lái)關(guān)于宏基因組的研究報(bào)道已經(jīng)超過(guò)1 200篇，而且呈現(xiàn)逐年升溫的趨勢(shì) (圖1)。宏基因組學(xué)在新型生物催化劑的研究中取得了令人矚目的進(jìn)展，成為國(guó)際生命科學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)之一。其基本策略流程為：采集樣品；提取特定環(huán)境中的基因組 DNA；構(gòu)建宏基因組文庫(kù)；篩選陽(yáng)性克隆子；目的基因的亞克隆和表達(dá)；目的催化劑的生化特性分析 (圖2)。近年來(lái)研究者們已利用宏基因組文庫(kù)技術(shù)從不同環(huán)境樣品中篩選到了脂肪酶/酯酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等多種具有工業(yè)應(yīng)用潛力的生物催化劑 (表1)。隨著宏基因組學(xué)在挖掘新型生物催化劑中的廣泛使用，我們進(jìn)入了宏基因組學(xué)挖掘生物催化劑的時(shí)代[7]。本文著重從宏基因組學(xué)研究的樣品來(lái)源、宏基因組DNA的提取、宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建和目標(biāo)克隆的篩選策略4個(gè)關(guān)鍵方面著手，系統(tǒng)綜述了采用宏基因組學(xué)方法進(jìn)行新型生物催化劑研究的現(xiàn)狀，并對(duì)今后的研究和發(fā)展方向提出了展望。

圖1 近年來(lái)宏基因組學(xué)研究的報(bào)道情況Fig. 1 Research papers on Metagenomics in recent years.

1 宏基因組文庫(kù)的樣品來(lái)源

微生物數(shù)量巨大，種類繁多，廣泛分布于不同的物理化學(xué)環(huán)境，在自然界長(zhǎng)期緩慢的進(jìn)化過(guò)程中，已經(jīng)產(chǎn)生了功能多樣的、在不同生理環(huán)境下具有高度精確性和特異性的生物催化劑，適應(yīng)了各自的環(huán)境。所以，自然界的微生物中隱藏了一個(gè)巨大的寶藏，蘊(yùn)藏著大量適于不同工業(yè)生產(chǎn)條件 (溫度、pH、壓力、離子強(qiáng)度和化合物濃度)的生物催化劑，且不同微環(huán)境中生物催化劑的種類和生化性質(zhì)大不相同，而人們一直在尋找的某種生物催化劑很有可能已經(jīng)存在于某一特定環(huán)境的微生物中了[7]。因此，在采用宏基因組學(xué)方法挖掘生物催化劑時(shí)，樣品來(lái)源格外重要。隨著構(gòu)建的宏基因組文庫(kù)類型的日漸增多，Ivanova等[35]認(rèn)為有必要將宏基因組文庫(kù)進(jìn)行分類，以便對(duì)不同環(huán)境中的基因組信息進(jìn)行比較分析。迄今為止，為了篩選生物催化劑，研究者們構(gòu)建了各種各樣的環(huán)境樣品文庫(kù)，它們的樣品來(lái)源可歸為5大類：陸地環(huán)境，水生環(huán)境，寄生環(huán)境，人工環(huán)境及其他特殊環(huán)境 (表2)。

圖2 宏基因組學(xué)策略挖掘生物催化劑的流程圖Fig. 2 General process of metagenomic strategies in mining biocatalysts

表1 近年來(lái)構(gòu)建的宏基因組文庫(kù)及篩選到的生物催化劑Table 1 Examples of isolated biocatalysts from metagenomic libraries in recent years

目前，宏基因組學(xué)研究的樣品主要來(lái)源于土壤環(huán)境和海洋環(huán)境。這是因?yàn)橥寥谰哂形⑸镞M(jìn)行生長(zhǎng)繁殖和生命活動(dòng)所需的各種條件，是微生物生活的最適宜環(huán)境。據(jù)估計(jì)，每克土壤中含有高達(dá)10 000種不同的微生物[36]，這表明土壤微生物宏基因組是一個(gè)巨大的基因資源庫(kù)，對(duì)它們的挖掘能夠獲得大量的生物酶制劑[37]；而海洋環(huán)境在壓力、鹽分、溫度和營(yíng)養(yǎng)成分上的極端變化賦予了海洋微生物在物種資源、基因功能和生態(tài)功能上無(wú)與倫比的生物多樣性。本實(shí)驗(yàn)室從紅樹林、農(nóng)藥污染的棉田、油田等環(huán)境的土壤樣品中篩選到了酯酶[18]、漆酶[25]、β-半乳糖苷酶[26]、阿魏酸酯酶[27]、單寧酶[28]，并在此基礎(chǔ)上研究了這些新型生物催化劑的酶學(xué)特性。

為了獲得性能更加多樣的生物催化劑，研究者們需要廣泛地采集環(huán)境樣品，特別是一些極端環(huán)境中的樣品。

表2 宏基因組文庫(kù)樣品來(lái)源的分類Table 2 Classification of samples used for metagenomic library construction

2 宏基因組DNA的提取

宏基因組DNA的提取是構(gòu)建宏基因組文庫(kù)的關(guān)鍵步驟，因?yàn)榄h(huán)境樣品總DNA的濃度、純度、片段大小和偏好性等因素將直接影響宏基因組文庫(kù)的質(zhì)量和代表性。DNA提取方法大體可分為兩類：直接提取法和間接提取法。

直接提取法，又稱原位裂解法，這類方法是通過(guò)物理法、化學(xué)法或酶解法直接裂解環(huán)境樣品中微生物的細(xì)胞壁來(lái)提取DNA并加以純化。目前常用的裂解方法中，物理法有反復(fù)凍融法、超聲法、玻璃珠擊打法、液氮碾磨法等；化學(xué)法所采用的化學(xué)試劑有表面活性劑 (如SDS)、鹽類、有機(jī)溶劑等；酶解法則主要采用溶菌酶和蛋白酶K。不同裂解法的差別在于細(xì)胞破壁的方式不同。直接提取法無(wú)需對(duì)環(huán)境樣品中的微生物進(jìn)行復(fù)蘇處理，操作簡(jiǎn)便，且樣品中的微生物能夠被裂解得比較完全，故DNA提取得率高，所獲得的基因組DNA能較好地反映樣品中微生物種群的多樣性。但由于操作過(guò)程中機(jī)械剪切力大，導(dǎo)致所獲得的 DNA片段較小 (1~50 kb)，且多為平端；此外，由于提取的基因組DNA中混有金屬離子、腐殖酸、多糖、多酚化合物等雜質(zhì)，純度較低，往往還需要經(jīng)過(guò)純化處理才能滿足后續(xù)分子生物學(xué)操作 (如DNA酶切、PCR擴(kuò)增) 的需要。該法提取的DNA主要適用于以質(zhì)粒或λ噬菌體為載體的小片段文庫(kù)的構(gòu)建。

間接提取法，又稱異位裂解法，是利用梯度離心或者差速離心等方法先把微生物從環(huán)境樣品中分離出來(lái)，然后再用比較溫和的方法提取基因組 DNA。該方法受土壤中雜質(zhì)的污染較小，提取條件比較溫和，所獲得的DNA純度較高，片段大 (20~500 kb)，適合于構(gòu)建以柯斯粘粒(Cosmid) 和細(xì)菌人工染色體 (Bacterial artificial chromosome，BAC) 為載體的大片段文庫(kù)；但該方法操作繁瑣，前分離過(guò)程會(huì)造成部分微生物細(xì)胞的丟失，加上溫和條件下細(xì)胞壁較厚的微生物不易被裂解，因此所獲得的DNA中基因組信息的廣泛性不及原位裂解法，得率只有原位裂解法的1%~10%[37]。

從DNA產(chǎn)率、純度、片段長(zhǎng)度及對(duì)整個(gè)微生物群落的覆蓋率等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，直接法和間接法各有優(yōu)勢(shì)和不足[38]?？傮w來(lái)看，國(guó)內(nèi)外學(xué)者和研究人員采用直接提取法的較多。針對(duì)直接提取法得到的環(huán)境總DNA中雜質(zhì)較多的問(wèn)題，研究者們建立了多種 DNA提取純化方法。Zhou等[39]通過(guò)在基因提取過(guò)程中使用PVPP和CTAB去除多糖和腐植酸，獲得了適于建庫(kù)的高質(zhì)量環(huán)境總 DNA，此方法在后來(lái)的宏基因組學(xué)研究中被廣泛采用；Braid等[40]通過(guò)絮凝作用有效地去除雜質(zhì)；Desai等[41]采用溫和的裂解方法裂解土壤微生物，然后通過(guò)活性炭吸附和離子交換層析兩步法有效地去除了土壤中的離子和腐植酸等抑制劑，得到了可用于 PCR反應(yīng)的高純度和高濃度土壤總DNA；Pang等[42]針對(duì)堆肥環(huán)境中高濃度腐殖酸的存在 (堆肥的腐殖酸含量比土壤高10~100倍)，使用Sephadex G200＋酸洗PVPP層析柱與電洗脫兩步純化的方法純化堆肥環(huán)境來(lái)源的DNA，成功地構(gòu)建了一個(gè)含有10萬(wàn)個(gè)克隆的柯斯質(zhì)粒文庫(kù)，并從這個(gè)文庫(kù)中篩選到一個(gè)新的β-葡萄糖苷酶基因。本實(shí)驗(yàn)室在Zhou法[39]基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，選用商品化的凝膠回收試劑盒對(duì)DNA粗提液進(jìn)行純化回收，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，回收效率高，采用此法構(gòu)建了棉田土壤宏基因組文庫(kù)，并從中篩選得到一個(gè)具有菊酯農(nóng)藥降解酶活性、阿魏酸酯酶活性和單寧酶活性的酶蛋白的基因[28]。

隨著宏基因組學(xué)的發(fā)展，許多新的DNA提取技術(shù)不斷被提出，使得人們可以從各種各樣的環(huán)境樣品中獲得高質(zhì)量的總 DNA。然而，并沒有一種標(biāo)準(zhǔn)的或通用的環(huán)境DNA提取方法。任何DNA提取方法都存在一定的偏好性，導(dǎo)致選擇性地富集某些微生物的 DNA，同時(shí)選擇性地遺漏某些微生物的 DNA，從而影響所提取的DNA的種群覆蓋率。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)所研究生境的特性和研究目的進(jìn)行選擇和優(yōu)化。

3 宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建

3.1 載體的選擇

載體在宏基因組技術(shù)中具有重要地位，常用載體有質(zhì)粒 (Plasmid)、細(xì)菌人工染色體 (BAC)、柯斯粘粒 (Cosmid)、福斯黏粒 (Fosmid)等，此外還有噬菌體P1克隆系統(tǒng) (P1-clone)、由P1衍生 的 人 工 染 色 體 (P1-derived artificial chromosome，PAC)、酵母人工染色體 (Yeast artificial chromosomes，YAC)和哺乳動(dòng)物人工染色體 (Mammalian artificial chromosome，MAC)等 (表3)。目前，在新型催化劑的研究中，所采用的載體有質(zhì)粒、Cosmid、Fosmid、BAC、λ噬菌體以及各種穿梭載體等。載體的選擇應(yīng)考慮以下因素：研究目的、所提取的環(huán)境總DNA的質(zhì)量、欲插入目的片段的最大長(zhǎng)度、所需要的載體拷貝數(shù)、欲采用的宿主以及篩選策略。如對(duì)腐殖質(zhì)含量較高或剪切較嚴(yán)重的DNA樣品適宜構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)，而對(duì)于含較大基因簇或大片段的DNA樣品則適宜構(gòu)建Cosmid、Fosmid或BAC文庫(kù)。但是，無(wú)論以何種載體構(gòu)建文庫(kù)，都必須使文庫(kù)最大程度地覆蓋樣本中所有微生物的基因組。

3.2 宿主的選擇

宿主的選擇應(yīng)考慮以下因素：所選擇的載體類型，宿主的轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性、宿主能否為相關(guān)功能基因提供必需的轉(zhuǎn)錄表達(dá)體系、對(duì)異源表達(dá)基因產(chǎn)物是否有較強(qiáng)的相容性、以及目標(biāo)性狀 (如抗菌性) 缺陷型等。目前，構(gòu)建用于篩選新酶的宏基因組文庫(kù)時(shí)，最常用的宿主為大腸桿菌E. coli，其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、繁殖迅速、培養(yǎng)代謝易于控制、遺傳信息明確。其次是芽胞桿菌 Bacillus、變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans 和 惡 臭 假 單 胞 菌Pseudomonas putida[8,43]。

表3 宏基因組文庫(kù)常用載體比較Table 3 Comparison of different vectors used in metagenomic library construction

4 目標(biāo)克隆的篩選

由于環(huán)境樣品中微生物種類眾多，文庫(kù)容量龐大，如何有效得到目標(biāo)克隆，是研究者們必須解決的一個(gè)難題。目前，從宏基因組文庫(kù)中篩選新型生物催化劑的策略可分為3種：基于活性的篩選，基于序列的篩選和底物誘導(dǎo)的篩選。

4.1 基于活性的篩選

基于活性的篩選 (Activity-based screening)，也稱功能驅(qū)動(dòng)篩選 (Function-driven screening)，是指通過(guò)活性檢測(cè)手段從基因組文庫(kù)中獲得具有特殊活性的克隆方法。該方法經(jīng)常借助于顯色反應(yīng)、選擇性表型和形成水解圈等特性進(jìn)行篩選，如 Diaz-Torres等[44]將構(gòu)建的口腔唾液宏基因組文庫(kù)涂布于含有四環(huán)素的LB平板上，篩選得到了一個(gè)四環(huán)素抗性基因；本實(shí)驗(yàn)室利用生色底物 5-溴-4-3-吲哚-辛酸鹽 (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-caprylate，X-cap) 和 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半 乳 糖 苷 (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-gal) 水解后會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)的特性，從土壤宏基因組文庫(kù)中分別篩選到了多個(gè)酯酶基因[18]和 β-半乳糖苷酶基因[26]。目前已利用基于活性的篩選方法獲得了許多新型生物催化劑，如木聚糖酶、纖維素酶、酯酶和脂肪酶等[45]。該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是：不依賴于已知序列的信息，故能夠篩選到具有優(yōu)良特性的酶。此外，該方法還可以快速鑒別有開發(fā)潛力的克隆子及全長(zhǎng)基因，在工業(yè)生物催化劑的開發(fā)上具有一定的用途。但此方法也存在以下缺點(diǎn)：1) 由于目前DNA文庫(kù)的構(gòu)建中所采用的克隆系統(tǒng)是大腸桿菌系統(tǒng)，真核生物的基因在這個(gè)系統(tǒng)中往往無(wú)法表達(dá)，因而提取到的宏基因組中存在的真核生物基因組DNA會(huì)影響到基因組文庫(kù)的篩選效率；2) 受所選擇的表達(dá)系統(tǒng)的影響 (宏基因組來(lái)源的基因轉(zhuǎn)錄效率低；翻譯效率低；外源蛋白質(zhì)難以分泌到胞外；目標(biāo)蛋白質(zhì)由于缺乏分子伴侶形成不正確的折疊；缺乏合成的輔因子；與宿主菌密碼子使用存在差異)，導(dǎo)致許多基因無(wú)法正確表達(dá)而遺漏；3) 工作量大，篩選效率較低，有時(shí)需要分析幾千甚至幾萬(wàn)個(gè)克隆子才能檢測(cè)到一個(gè)陽(yáng)性克隆子。針對(duì)上述不足，研究者們提出了一些改進(jìn)方法，如在DNA提取過(guò)程中，通過(guò)差速離心法去除樣品中的真核生物，從而減少總DNA中的真核生物DNA[42]；應(yīng)用穿梭載體構(gòu)建文庫(kù)，從而使宏基因組DNA能夠在大腸桿菌、鏈霉菌、或者假單胞菌中穩(wěn)定表達(dá)[46-47]；也有對(duì)大腸桿菌進(jìn)行修飾以增加基因的表達(dá)范圍[46]?？偠灾僮鲿r(shí)應(yīng)注意選擇合適的載體/宿主系統(tǒng)，優(yōu)化篩選方法，這樣才能提高挖掘新型生物催化劑的效率。

4.2 基于序列的篩選

基于序列的篩選是以序列相似性為基礎(chǔ)，根據(jù)已知相關(guān)功能基因的保守序列設(shè)計(jì)探針或PCR引物，然后通過(guò)雜交或PCR擴(kuò)增來(lái)篩選目標(biāo)克隆。不斷擴(kuò)大的基因庫(kù)為這種方法提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。迄今采用這種方法篩選到的新型催化劑有纖維素酶[11]、鐵過(guò)氧化物歧化酶[14]、脂肪酶[17]，延胡索酸酶[21]、木聚糖酶[32]等。與活性篩選法相比，該方法不依賴于重組基因在外源宿主中表達(dá)，且利用基因芯片技術(shù)、基因盒系統(tǒng)、熒光原位雜交技術(shù) (Fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH) 和微陣列技術(shù) (Microarray)還可大大提高篩選效率，并有望獲得基因的全長(zhǎng)序列。但是該方法仍然存在3個(gè)主要的缺陷：1) 由于探針和引物是基于已知序列的保守區(qū)域，而大部分具有實(shí)際用途的基因在序列上差相很大，通過(guò) PCR擴(kuò)增或探針雜交很難找到全新的同源基因，因此難以發(fā)現(xiàn)新型的酶分子，但有可能篩選到某一類結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)中的新分子；2) 一般只能獲得結(jié)構(gòu)基因的一個(gè)片段，而不是全長(zhǎng)基因；3) 對(duì)于新鑒定或推測(cè)的功能基因需要通過(guò)生化測(cè)定進(jìn)一步驗(yàn)證。

4.3 底物誘導(dǎo)的篩選

底物誘導(dǎo)篩選 (Substrate induced gene expression screening，SIGEX) 由Uchiyama等[34]于2005年首次提出，用于篩選那些受底物誘導(dǎo)的靶標(biāo)基因。Uchiyama等成功的關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)了一個(gè)具有操縱子陷阱 (Operon-trap) 的載體 (命名為 p18GFP)，該載體含有一個(gè)報(bào)告基因——綠色熒光蛋白基因 (gfp)，并將多克隆位點(diǎn)置于lac啟動(dòng)子和gfp基因之間，使gfp基因的表達(dá)受到插入片段中啟動(dòng)子的調(diào)控。這樣的設(shè)計(jì)保證了p18GFP載體既能用于構(gòu)建文庫(kù)，又能使用熒光激活細(xì)胞分離儀 (Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS) 進(jìn)行高通量篩選[34,48-49]。Uchiyama等采用 p18GFP載體構(gòu)建了一個(gè)含有152 000個(gè)克隆子的基因組文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)進(jìn)行SIGEX分析：以苯甲酸鹽為底物得到58個(gè)陽(yáng)性克隆子；以萘為底物得到4個(gè)陽(yáng)性克隆子。整個(gè)篩選過(guò)程只用了4 d。由此可見，該方法靈敏度高、快速經(jīng)濟(jì)，而且不需要對(duì)底物進(jìn)行修飾；可以從底物推斷出目標(biāo)基因的功能。但 SIGEX法存在以下缺陷：1) 無(wú)法利用不能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的底物，從而無(wú)法誘導(dǎo)相關(guān)目的基因的表達(dá)。因此，SIGEX法不能用于篩選大分子底物的酶如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和木聚糖酶等[51]，而這些酶在工業(yè)上具有重要用途；2) 對(duì)目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)和插入方向敏感，容易導(dǎo)致漏檢，如SIGEX無(wú)法檢出組成型表達(dá)的目標(biāo)基因，也無(wú)法檢出與gfp基因插入方向相反的目標(biāo)基因[50-51]；3) 當(dāng)分解代謝基因和 gfp基因之間存在轉(zhuǎn)錄終止子時(shí)，陽(yáng)性克隆子無(wú)法被檢出，而大的插入片段中通常含有高豐度的轉(zhuǎn)錄終止子，所以SIGEX法不能有效篩選大片段插入文庫(kù)[51]；4) 有時(shí)僅能獲得基因的部分片段[49]；5) 對(duì)設(shè)備要求較高，應(yīng)用受到一定的限制。

以上3種篩選方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，研究者應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。鑒于它們之間可以相互補(bǔ)充，因此，將它們巧妙結(jié)合可以大大提高宏基因組文庫(kù)的篩選效率。

5 展望

應(yīng)用宏基因組學(xué)挖掘新型生物催化劑是宏基因組學(xué)研究中的一個(gè)重要方向，引起了全世界科研工作者的關(guān)注。但在研究過(guò)程中還存在一些亟待解決的問(wèn)題。首先，現(xiàn)行的環(huán)境樣品 DNA提取方法還存在很多不足，導(dǎo)致某些環(huán)境樣品中的基因組DNA無(wú)法被有效提?。黄浯?，目前使用的載體/宿主系統(tǒng)使得很多基因 (特別是真核微生物的基因) 無(wú)法進(jìn)行異源表達(dá)，無(wú)法利用基于活性的篩選及底物誘導(dǎo)篩選兩種策略進(jìn)行篩選；再次，現(xiàn)行的各種篩選方法都存在一些缺陷，無(wú)法對(duì)宏基因組文庫(kù)進(jìn)行全面而有效的篩選；最后，篩選獲得的生物催化劑在酶學(xué)性質(zhì)上還存在很多不足，無(wú)法應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)目前研究中存在的問(wèn)題，可以從以下幾個(gè)方面著手：1) 與傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，使一些不可培養(yǎng)的微生物能夠進(jìn)行富集培養(yǎng)，同時(shí)嘗試更多的環(huán)境樣品DNA提取純化方法，使提取的DNA在產(chǎn)率、純度、片段長(zhǎng)度及種群覆蓋率等方面不斷提高；2) 探索更加適合構(gòu)建宏基因組文庫(kù)的載體和真核表達(dá)宿主，同時(shí)與宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合，挖掘存在于真核微生物中的生物催化劑；3) 與生物信息學(xué)結(jié)合，設(shè)計(jì)更加多樣、完備的探針和PCR引物，開發(fā)更加靈敏、快速、高效的檢測(cè)手段，提高篩選目標(biāo)克隆的效率；4) 與蛋白質(zhì)工程結(jié)合，對(duì)已獲得的生物催化劑進(jìn)行改造以獲得高性能的工業(yè)生物催化劑。隨著生物學(xué)的不斷發(fā)展，DNA提取方法的突破，更適宜的載體和宿主的獲得，文庫(kù)構(gòu)建水平和篩選效率的不斷提高，宏基因組來(lái)源的工業(yè)生物催化劑將會(huì)不斷地被挖掘出來(lái)，進(jìn)而極大地推動(dòng)工業(yè)生物技術(shù)的進(jìn)步。

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